蛋白質提取與純化技巧——hjc黄金城生物醫藥

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蛋白質的純化對於蛋白質的鑒定，功能，結構及相互作用的研究是至關重要的。蛋白質分離純化是用生物工程下遊技術從混合物之當中分離純化出所需要得目的蛋白質的方法，是當代生物產業當中的核心技術。

蛋白質的純化方法主要是利用不同蛋白質之間的相似性與差異，依據蛋白之間的相似性可以去除非蛋白物質，再根據蛋白質的差異性將目的蛋白分離出來。蛋白質的分離純化根據蛋白質本身的性質可以分為多種方法。

以蛋白質和結構與功能為基礎，從分子程度上認識生命景象，已經成為現代生物學發展的主要方向，研究蛋白質，首先要得到高度純化並具備生物活性的目標物質。蛋白質的製備工作觸及物理、化學和生物等各方麵知識，但基本原理不外乎兩方麵。一是得用混雜物中幾個組分分配率的差別，把它們分配到可用機械方法分別的兩個或幾個物相中，如鹽析，有機溶劑提取，層析和結晶等；二是將混雜物置於單一物相中，經過物理力場的作用使各組分分配於來同區域而達到分別目標，如電泳，超速離心，超濾等。在所有這些方法的運用中必須留意保留生物大分子的完好性，避免酸、鹼、高溫，強烈機械作用而導致所提物質生物活性的喪失。蛋白質的製備通常分為以下四個階段：選擇材料和預解決，細胞的破碎及細胞器的分別，提取和純化，濃細、單和諧保留。

微生物、植物和動物都可做為製備蛋白質的原材料，所選用的材料主要依據實驗目標來判別。對於微生物，應留意它的生長期，在微生物的對數生長期，酶和核酸的含量較高，能夠獲得高產量，以微生物為材料時有兩種情況：

（1）得用微生物菌體分泌到培養基中的代謝產物和胞外酶等；

（2）利用菌體含有的生化物質，如蛋白質、核酸和胞內酶等。植物材料必須經過去殼，脫脂並留意植物品種和生長發育情況不同，其中所含生物大分子的量變革很大，另外與季節性關係親密。對動物組織，必須選擇有效成份含量豐盛的髒器組織為原材料，先進行絞碎、脫脂等解決。另外，對預解決好的材料，若不立刻進行實驗，應冷凍保留，對於易分解的生物大分子應選用新鮮材料製備。

蛋白質的分離純化

一、蛋白質（包括酶）的提取大部分蛋白質都可溶於水、稀鹽、稀酸或堿溶液，少數與脂類聯結的蛋白質則溶於乙醇、丙酮、丁醇等有機溶劑中，因些，可采取不同溶劑提取分別和純化蛋白質及酶。

（一）水溶液提取法

稀鹽和緩衝係統的水溶液對蛋白質鞏固性好、溶解度大、是提取蛋白質最常用的溶劑，通常用量是原材料體積的1—5倍，提取時需要均勻的攪拌，以利於蛋白質的溶解。提取的溫度要視有效成份性質而定。一方麵，多數蛋白質的溶解度隨著溫度的升高而增大，因此，溫度高利於溶解，縮短提取時間。但另一方麵，溫度升高會使蛋白質變性失活，因此，基於這一點思索提取蛋白質和酶時通常采取低溫（5度以下）操作。為了避免蛋白質提以進程中的降解，可加入蛋白水解酶抑製劑（如二異丙基氟磷酸，碘乙酸等）。

下麵著重議論提取液的pH值和鹽濃度的選擇。

1、pH值蛋白質，酶是具備等電點的兩性電解質，提取液的pH值應選擇在偏離等電點兩側的pH領域內。用稀酸或稀堿提取時，應避免過酸或過堿而引起蛋白質可解離基團發生變革，從而導致蛋白質構象的不可逆變革，通常來說，堿性蛋白質用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白質用偏堿性的提取液。

2、鹽濃度

稀濃度可增進蛋白質的溶，稱為鹽溶作用。同時稀鹽溶液因鹽離子與蛋白質部分聯結，具備保護蛋白質不易變性的優點，因此在提取液中加入少量NaCl等中性鹽，通常以0。15摩爾。升濃度為宜。緩衝液常采取0。02—0。05M磷酸鹽和碳酸鹽等滲鹽溶液。

（二）有機溶劑提取法

一些和脂質聯結比較牢固或分子中非極性側鏈較多的蛋白質和酶，不溶於水、稀鹽溶液、稀酸或稀堿中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有機溶劑，它們具的一定的親水性，還有較強的親脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。但必須在低溫下操作。丁醇提取法對提取一些與脂質聯結緊密的蛋白質和酶特別優勝，一是因為丁醇親脂性強，特別是溶解磷脂的能力強；二是丁醇兼具親水性，在溶解度領域內（度為10％，40度為6。6％）不會引起酶的變性失活。另外，丁醇提取法的pH及溫度選擇領域較廣，也適用於動植物及微生物材料。

二、蛋白質的分離純化

蛋白質的分離純化方法很多，主要有：

（一）依據蛋白質溶解度不同的分別方法

1、蛋白質的鹽析

中性鹽對蛋白質的溶解度有顯然影響，通常在低鹽濃度下隨著鹽濃度升高，蛋白質的溶解度增長，此稱鹽溶；當鹽濃度延續升高時，蛋白質的溶解度不同程度下降並先後析出，這種景象稱鹽析，將大批鹽加到蛋白質溶液中，高濃度的鹽離子（如硫酸銨的SO4和NH4）有很強的水化力，可奪取蛋白質分子的水化層，使之“失水”，於是蛋白質膠粒凝結並積澱析出。鹽析時若溶液pH在蛋白質等電點則效果更好。因為各種蛋白質分子顆粒大小、親水程度不同，故鹽析所需的鹽濃度也不一樣，因此調節混雜蛋白質溶液中的中性鹽濃度可使各種蛋白質分段積澱。

影響鹽析的因素有：

（1）溫度：除對溫度敏感的蛋白質在低溫（4度）操作外，通常可在室溫中進行。通常溫度低蛋白質溶介度下降。但有的蛋白質（如血紅蛋白、肌紅蛋白、清蛋白）在較高的溫度（25度）比0度時溶解度低，更容易鹽析。

（2）PH值：大多數蛋白質在等電點時在濃鹽溶液中的溶介度最低。

（3）蛋白質濃度：蛋白質濃度高時，欲分別的蛋白質經常攙和著其餘蛋白質地一起積澱出來（共沉景象）。因此在鹽析前血清要加等量生理鹽水稀釋，使蛋白質含量在2.5—3.0％。

蛋白質鹽析常用的中性鹽，主要有硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉等。

其中運用最多的硫酸銨，它的優點是溫度係數小而溶解度大（25度時飽和溶液為4。1M，即767克／升；0度時飽和溶解度為3。9M，即676克／升），在這一溶解度領域內，許多蛋白質和酶都能夠鹽析出來；另外硫酸銨分段鹽析效果也比其餘鹽好，不易引起蛋白質變性。硫酸銨溶液的pH常在4。5—5。5之間，當用其餘pH值進行鹽析時，需用硫酸或氨水調節。

蛋白質在用鹽析積澱分別後，需要將蛋白質中的鹽除去，常用的辦法是透析，即把蛋白質溶液裝入秀析袋內（常用的是玻璃紙），用緩衝液進行透析，並不斷的改換緩衝液，因透析所需時間較長，所以最好在低溫中進行。此外也可用葡萄糖凝膠G—25或G—50過柱的辦法除鹽，所用的時間就比較短。

2、等電點積澱法

蛋白質在靜電情況時顆粒之間的靜電斥力最小，因此溶解度也最小，各種蛋白質的等電點有差別，可利用調節溶液的pH達到某一蛋白質的等電點使之積澱，但此法很少獨自使用，可與鹽析法聯結用。

3、低溫有機溶劑積澱法

用與水可混溶的有機溶劑，甲醇，乙醇或丙酮，可使多數蛋白質溶解度下降並析出，此法辨別力比鹽析高，但蛋白質較易變性，應在低溫下進行。

（二）依據蛋白質分子大小的差別的分別方法

1、透析與超濾

透析法是利用半透膜將分子大小不同的蛋白質分開。

超濾法是利用高壓力或離心力，強使水和其餘小的溶質分子經過半透膜，而蛋白質留在膜上，可選擇不同孔徑的瀘膜截留不同分子量的蛋白質。

2、凝膠過濾法

也稱分子排阻層析或分子篩層析，這是依據分子大小分別蛋白質混雜物最有效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝膠（Sephadexged）和瓊脂糖凝膠（agarosegel）。

（三）依據蛋白質帶電性質進行分別蛋白質在不同pH環境中帶電性質和電荷數量不同，可將其分開。

1、電泳法

各種蛋白質在同一pH條件下，因分子量和電荷數量不同而在電場中的遷移率不同而得以分開。值得重視的是等電聚焦電泳，這是利用一種兩性電解質作為載體，電泳時兩性電解質形成一個由正極到負極逐步增長的pH梯度，當帶一定電荷的蛋白質在其中泳動時，達到各自等電點的pH位置就停滯，此法可用於分析和製備各種蛋白質。

2、離子交換層析法

離子交換劑有陽離子交換劑（如：羧甲基纖維素；CM—纖維素）和陰離子交換劑（二乙氨基乙基纖維素），當被分別的蛋白質溶液流經離子交換層析柱時，帶有與離子交換劑相反電荷的蛋白質被吸附在離子交換劑上，隨後用改變pH或離子強度辦法將吸附的蛋白質洗脫下來。

（四）依據配體神奇性的分別方法—親和色譜法親和層析法（aflinitychromatography）是分別蛋白質的一種極為有效的方法，它經常隻需經過一步解決即可使某種待提純的蛋白質從很龐雜的蛋白質混雜物中分別出來，而且純度很高。這種方法是依據某些蛋白質與另一種稱為配體（Ligand）的分子能神奇而非共價地聯結。其基本原理：蛋白質在組織或細胞中是以龐雜的混雜物情勢存在，每品種型的細胞都含有上千種不同的蛋白質，因此蛋白質的分別（Separation），提純（Purification）和鑒定（Characterization）是生物化學中的重要的一部分，至今還沒的獨自或一套現成的方法能移把任何一種蛋白質從龐雜的混雜蛋白質中提取出來，因此經常采取幾種方法聯結使用。

細胞的破碎

1、高速組織搗碎：將材料配成稀糊狀液，放置於筒內約1／3體積，蓋緊筒蓋，將調速器先撥至最慢處，開動開關後，逐步加速至所需速度。此法適用於動物內髒組織、植物肉質種子等。

2、玻璃勻漿器勻漿：先將剪碎的組織置於管中，再套入研杆來回研磨，上下移動，即可將細胞研碎，此法細胞破碎程度比高速組織搗碎機為高，適用於量少和動物髒器組織。

3、超聲波解決法：用一定功率的超聲波解決細胞懸液，使細胞急劇震動破裂，此法多適用於微生物材料，用大腸杆菌製備各種酶，常選用50—100毫克菌體／毫升濃度，在1KG至10KG頻率下解決10—15分鍾，此法的缺陷是在解決進程會產生大批的熱，應采取相應降溫辦法。對超聲波敏感和核酸應慎用。

4、反複凍融法：將細胞在—20度以下冰凍，室溫融解，反複幾次，因為細胞內冰粒形成和剩餘細胞液的鹽濃度增高引起溶脹，使細胞結構破碎。

5、化學解決法：有些動物細胞，例如腫瘤細胞可采取十二烷基磺酸鈉（SDS）、脫氧膽酸鈉等細胞膜損壞，細菌細胞壁較厚，可采取溶菌酶解決效果更好。

無論用哪一種方法破碎組織細胞，都會使細胞內蛋白質或核酸水解酶釋放到溶液中，使大分子生物降解，導致天然物品質的減少，加入二異丙基氟磷酸（DFP）能夠抑製或減慢自溶作用；加入碘乙酸能夠抑製那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能消除蛋白水解酥生機，但不是全體，還可經過選擇pH、溫度或離子強度等，使這些條件都要適宜於目標物質的提取。

濃縮、單調及保留

一、樣品的濃縮

生物大分子在製備進程中因為過柱純化而樣品變得很稀，為了保留和鑒定的目標，經常需要進行濃縮。常用的濃縮方法的：

1、減壓加溫蒸發濃縮

經過下降液麵壓力使液體沸點下降，減壓的真空度愈高，液體沸點降得愈低，蒸發愈快，此法適用於一些不耐熱的生物大分子的濃縮。

2、空氣流動蒸發濃縮

空氣的流動可使液體加速蒸發，鋪成薄層的溶液，外表不斷經過空氣流；或將生物大分子溶液裝入透析袋內置於冷室，用電扇對準吹風，使透過膜外的溶劑不沁蒸發，而達到濃縮目標，此法濃縮速度慢，不適於大批溶液的濃縮。

3、冰凍法

生物大分子在低溫結成冰，鹽類及生物大分子不進入冰內而留在液相中，操作時先將待濃縮的溶液冷卻使之變成固體，此後遲緩地融解，利用溶劑與溶質融點介點的差別而達到除去大部分溶劑的目標。如蛋白質和酶的鹽溶液用此法濃縮時，不含蛋白質和酶的純冰結晶浮於液麵，蛋白質和酶則集中於下層溶液中，移去上層冰塊，可得蛋白質和酶的濃縮液。

4、吸收法

經過吸收劑直接受除去溶液中溶液分子使之濃縮。所用的吸收劑必須與溶液不起化學反應，對生物大分子不吸附，易與溶液分開。常用的吸收劑有聚乙二醇，聚乙稀吡咯酮、蔗糖和凝膠等，使用聚乙二醇吸收劑時，先將生物大分子溶液裝入半透膜的袋裏，外加聚乙二醇複蓋置於4度下，袋內溶劑滲出即被聚乙二醇迅速吸去，聚乙二醇被水飽和後要改換新的直至達到所需要的體積。

5、超濾法

超濾法是使用一種特別的薄膜對溶液中各種溶質分子進行選擇性過濾的方法，不液體在一定壓力下（氮氣壓或真空泵壓）經過膜時，溶劑和小分子透過，大分子碰壁保留，這是近年來發展起來的新方法，最適於生物大分子尤其是蛋白質和酶的濃縮或脫鹽，並具備成本低，操作便捷，條件柔和，能較好地維持生物大分子的活性，回收率高等優點。運用超濾法關鍵在於膜的選擇，不同類型和規格的膜，水的流速，分子量截止值（即大體上能被膜保留分子最小分子量值）等參數均不同，必須依據工作需要來選用。另外，超濾裝置情勢，溶質成份及性質、溶液濃度等都對超濾效果的一定影響。

用上麵的超濾膜製成空心的纖維管，將很多根這樣的管攏成一束，管的兩端與低離子強度的緩衝液相連，使緩衝液不斷地在管中流動。此後將纖維管浸入待透析的蛋白質溶液中。當緩衝液流過纖維管時，則小分子很易透過膜而擴散，大分子則不能。這就是纖維過濾秀析法，因為透析麵積增大，因此使透析時間縮短10倍。

二、單調

生物大分子製備得到產品，為避免變質，易於保留，常需要單調解決，最常用的方法是冷凍單和諧真空單調。真空單調適用於不耐高溫，易於氧化物質的單和諧保留，全部裝置包括單調器、冷凝器及真空單調原理外，同時增長了溫度因素。在相同壓力下，水蒸汽壓隨溫度下降而下降，故在低溫低壓下，冰很易升華為氣體。操作時通常先將待單調的液體冷凍到冰點以下使之變成固體，此後在低溫低壓下將溶劑變成氣體而除去。此法幹後的產品具備蓬鬆、溶解度好、維持天然結構等優點，適用於各類生物大分子的單調保留。

三、貯存

生物大分子的鞏固性與保留方法的很大關係。單調的製品通常比較鞏固，在低溫情況下其活性可在數日甚至數年無顯然變革，貯藏懇求容易，隻需將單調的樣品置於單調器內（內裝有單調解）密封，維持0—4度冰箱即可，液態貯藏時應留意以下幾點。

1、樣品不能太稀，必須濃縮到一定濃度能力封裝貯藏，樣品太稀易使生物大分子變性。

2、通常需加入防腐劑和鞏固劑，常用的防腐劑有甲苯、苯甲酸、氯仿、百裏酚等。蛋白質和酶常用的鞏固劑有硫酸銨糊、蔗糖、甘油等，如酶也可加入底物和輔酶以提高其鞏固性。此外，鈣、鋅、硼酸等溶液對某些酶也有一定保護作用。核酸大分子通常保留在氯化鈉或檸檬酸鈉的標準緩衝液中。

3、貯藏溫度懇求低，大多數在0度左右冰箱保留，有的則懇求更低，應視不同物質而定。

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