蛋白印跡(Western Blot)實驗技術服務

上海hjc黄金城的生物部在體外生物學領域有豐富廣泛的經驗，通過酶水平測定、細胞水平測定、細胞生物學、生物化學、體外同位素測定、穩定細胞株建立、基因敲除、RNAi和MicroRNA技術等，提供一套完整的生物學服務。

Western印跡分析

表達水平的Akt和磷酸化Akt在腫瘤的老鼠

蛋白印跡原理

    蛋白印跡實例

蛋白印跡法(Western blotting)是一種將高分辨率凝膠電泳和免疫化學分析技術相結合的雜交技術。免疫印跡法具有分析容量大、敏感度高、特異性強等優點，是檢測蛋白質特性、表達與分布的一種最常用的方法，如組織抗原的定性定量檢測、多肽分子的質量測定及病毒的抗體或抗原檢測等。免疫印跡常用於鑒定某種蛋白，並能對蛋白進行定性和半定量分析。

蛋白印跡(Western Blot)顯色的方法主要有以下幾種：
1. 放射自顯影
2. 底物化學發光ECL
3. 底物熒光ECF
4. 底物DAB呈色

免疫印跡基本步驟：
SDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白質的電泳方式，特別是用於蛋白質純度檢測和測定蛋白質分子量.PAGE能有效的分離蛋白質，主要依據其分子量和電荷的差異，而SDS-PAGE(SDS變性不連續聚丙烯酰胺凝膠電泳)的分離原理則僅根據蛋白質的分子量的差異，因為SDS-PAGE的樣品處理液是在要跑電泳的樣品中加入含有SDS，其可以斷開半胱氨酸殘基之間的二硫鍵，破壞蛋白質的四級結構，SDS是一種陰離子表麵活性劑即去汙劑，它可以斷開分子內和分子間的氫鍵，破壞蛋白質分子的二級及三級結構，並與蛋白質的疏水部分相結合，破壞其折疊結構，電泳樣品加入樣品緩衝液後，要在沸水中煮5分鍾變性使SDS與蛋白質充分結合形成SDS-蛋白質複合物，SDS-蛋白質複合物在強還原劑巰基乙醇存在時，蛋白質分子內的二硫鍵被打開而不被氧化，蛋白質也完全變性和解聚，並形成棒狀結構，穩定的存在於均一的溶液中，SDS與蛋白質結合後使SDS-蛋白質複合物上帶有大量的負電荷，平均每兩個氨基酸殘基結合一個SDS分子，這時各種蛋白質分子本身的電荷完全被SDS掩蓋，遠遠超過其原來所帶的電荷，從而使蛋白質原來所帶的電荷可以忽略不計，消除了不同分子之間原有的電荷差別，其電泳遷移率主要取決於亞基分子質量的大小，這樣分離出的譜帶也為蛋白質的亞基.樣品處理液中通常加入溴酚藍染料，溴酚藍指示劑是一個較小的分子，可以自由通過凝膠孔徑，所以它顯示著電泳的前沿位置，當指示劑到達凝膠底部時，即可停止電泳。另外樣品處理液中也可加入適量的甘油或蔗糖以增大溶液密度，使加樣時樣品溶液可以沉入樣品加樣槽底部。最常見的凝膠電泳緩衝液由Tris-glycine組成。緩衝液可以包含0.1%去汙劑，通常是SDS。Tris-glycine可用於分離很寬分子量範圍（6 - 200 kDa）的蛋白質，並且與變性或非變性條件相容。

免疫印跡法分三個階段進行：SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)——>電轉移——>酶免疫定位。免疫印跡檢測的具體操作過程存在很大差異。其中最常見的是直接和間接檢測，間接檢測法即一抗首先與抗原結合，再加入能與一抗特異結合標記過的二級抗體。標記物包括生物素、熒光探針（如熒光素和羅丹明）和酶（如HRP和AP）。這種方法的優點是單個二級抗體可測定多種多樣的一級抗體從而避免了逐一標記一級抗體，另一方麵一抗通常能與幾個二抗分子結合，從而起了信號放大的作用。其缺點是檢測過程增加了額外的溫育步驟。

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