美研| CMC係列(十三)：X射線粉末衍射法在藥物晶型定性分析中的應用

開篇引言

藥物固態表征方法有很多，X射線粉末衍射（XRPD）、熱重分析（TGA）、差示掃描量熱（DSC）、紅外（IR）、拉曼（Raman）、固態核磁（ssNMR）、動態水分吸附（DVS）、熱台顯微鏡、掃描電鏡（SEM）、偏振光顯微鏡（PLM）。其中，XRPD憑借快速、直觀、樣品用量少，樣品不被破壞可回收的優點，已成為藥物晶型研究的首選表征方法及金標準，廣泛用於藥物固態的定性和定量等研究，貫穿藥物固態研究的各個階段。

FDA Guidance: X-ray powder diffraction can also be used to provide unequivocal proof of polymorphism.

i. 《中國藥典》2020年版第四部0451專門闡述了藥品研究中X射線衍射法的應用；9015則指明了藥品晶型研究及晶型質量控製。
ii. 美國藥典（USP）941章節介紹了有關Characterization of Crystalline and Partially Crystalline Solids by X-Ray Powder Diffraction (XRPD)。
iii. 歐洲藥典（EP 10.8）在《5.9 Polymorphism》和《5.16 Crystallinity》中對晶型定義闡明了XRPD用於藥物晶型表征。
iv. 日本藥典（JP XVII）中收錄了晶型描述以及XRPD表征方法。

01 X射線衍射法和原理

X射線衍射法（XRPD, X-ray powder diffraction）是一種利用單色X射線光束照射到被測樣品上，檢測樣品的三維立體結構（含手性、晶型、結晶水或結晶溶劑）或成分（主成分及雜質成分、晶型種類及含量）的分析方法。其原理是：X射線是一種高能電磁波，能夠穿透物質並與其中的原子或者分子產生相互作用。當X射線照射原子排列規律不同的固體時，會產生不同的衍射圖譜。因此，不同晶型的XRPD譜圖往往差異很大，具有指紋屬性，易於區分，如圖1所示。

圖1. 幾何測量原理圖

02 X射線粉末衍射（XRPD）圖的組成

X射線粉末衍射圖是化合物結構參數間接信息，變化萬千，隨物質結構不同而異。那麽，該如何解讀衍射圖？

組成X射線粉末衍射圖的三要素為：峰位、峰強、峰形（線形）。衍射峰強受晶體結構、樣品特性（擇優取向、吸收、孔隙率）和儀器參數影響。晶型是由化合物的晶胞參數（a,b,c,a,β,γ）定義的，而晶胞參數（a,b,c,a,β,γ）影響的是衍射峰的峰位置。其他檢測指標如峰強度，則由原子參數決定，並受到擇優取向的影響。

因此，判斷晶型一致性時，取決於藥物晶型衍射峰的位置，而不是衍射峰的強度或強弱順序。

03 X射線粉末衍射（XRPD）的應用

1、區分晶態物質和非晶態物質（無定型）

中國藥典2020版0451指出，晶態物質的粉末X射線粉末衍射峰是由數十乃至上百個銳峰（窄峰）組成；而非晶態物質的粉末X射線粉末衍射峰的數量較少且呈彌散狀（為寬峰或饅頭峰），如圖2所示。

圖2.某一化合物結晶態和無定型的XRPD對比圖

2、鑒別多晶型

當某一化合物有兩種或兩種以上的不同固體物質狀態時，即存在有多晶型（或稱為同質異晶）現象。

多晶型現象可以由樣品的分子構象、分子排列規律、分子作用力等變化引起，也可由結晶水或結晶溶劑的加人（數量與種類）形成。不同晶型的XRPD圖在衍射峰數量、衍射峰位置、衍射峰強度以及衍射峰的形狀上顯現出差異。

化合物的每一種晶型都會產生一種特有的X射線粉末衍射圖，XRPD圖可以作為晶體的指紋圖譜，用於鑒定區分不同晶型，如圖3所示。

圖3. 某一化合物不同晶型的XRPD對比圖

3、評估物質的結晶度

當化合物結晶狀態比較好、結晶度比較高時，XRPD圖基線水平，峰形尖銳。反之，結晶度低時，基線不水平，出現漫散包，峰不尖銳，峰形寬化。

結晶度用來表示物相中結晶態物質所占的比例，同一種晶型，一般結晶度越高，熔點越高，如圖4所示。

圖4.同一晶型不同結晶度的XRPD對比圖

04 XRPD在晶型鑒別方麵常見的問題

多數情況下，晶型的判斷並不困難。隻要其XRPD譜圖一致（所有的衍射峰位置一致），就可以判斷為同一晶型。但是在實際晶型鑒別中，我們也會經常遇到以下問題：

i：單一晶型還是混晶？
ii：相似的XRPD圖，晶型是否一致？
iii：XRPD多峰或者少峰，晶型該如何判斷？
iv：XRPD峰偏移，晶型該如何判斷？
v：XRPD峰分叉晶型又該如何抉擇？

1、培養單晶，通過和單晶模擬的粉末衍射圖比對

單晶是判斷晶型是否為單一晶型最直接的方法。通過培養目標晶型的單晶，然後通過單晶數據模擬XRPD譜圖，與實測XRPD譜圖進行對比。如果一致，則說明是單一晶型，如圖5所示。

圖5. 某化合物單晶模擬和實測的XRPD對比圖

2、通過不同的結晶方式，獲得多批次樣品的XRPD

若多批次重結晶實驗（采用不同的結晶方式，不同的溶劑體係）獲得樣品的XRPD圖一致，那麽就可以認為是單一晶型，如圖6所示。

圖6.某化合物不同結晶方式獲得的XRPD對比圖

3、結合不同表征技術進行全麵的表征

DSC等輔助手段也可以用於是否單一晶型的判斷。如果是單一晶型，那應該有單一的熔化峰。如果DSC檢測有兩個或者多個熔化峰，則有可能是混晶。NMR、TGA、KF等則可以對水合物、溶劑化物的情況進行判斷。

4、晶型標準譜圖對比

和對照品XRPD圖對比，和專利文獻報道的XRPD譜圖對比，以確定當前製備的晶型是混晶還是單一晶型。

同種物質（單一成分或者包含溶劑）的不同晶型可能晶體結構相似。比如無水物和水合物之間，不同含水量的水合物之間，無水物和溶劑合物之間，水合物和溶劑合物之間，不同的溶劑合物之間就可能晶型結構相似，簡稱isostructural。

此外，不同物質其實也可能具有相似的結構（即相似的XRPD圖），比如氘代和非氘代化合物，異構體。對於這些情況，僅從XRPD圖譜是很難判斷的。需要結合項目背景信息，比如合成工藝，結晶工藝、化合物的多晶型情況，還需要結合其它表征手段綜合分析，才能得到客觀科學的結論，如圖7-圖9所示。

圖7.氘代和非氘代的XRPD對比圖

圖8.對映異構體（蘋果酸）的XRPD對比圖

圖9.某新藥不同溶劑合物的XRPD對比圖

在進行晶型一致性判斷時，少峰的情況（與標準品對比）相對問題較小，可以認為是該批次樣品可能由於結晶情況與以往批次不同，導致某個或者某些晶麵結晶度比較低，因而沒有出峰。比較難判斷的是XRPD譜圖多峰的情況，出現多峰的情況，一定要引起重視。

擇優取向常發生在片狀和針狀晶體。比較極端的情況，某些比較弱的衍射峰會消失，但對其研磨後衍射峰會出現。無論是片狀晶體還是針狀晶體，在研磨後，樣品的形貌會趨向於不規則和隨機的分布，此時每個晶麵暴露在X射線下的概率也會趨向於一致，所以XRPD衍射峰就沒有明顯的擇優取向。當然，研磨有可能會導致樣品結晶度下降，甚至變為無定形，所以研磨時要注意研磨的強度和時間，如圖10-圖13所示。

圖10.混晶引起的XRPD多峰圖

圖11.外來物引起的XRPD多峰圖

圖12.溶劑引起的XRPD多峰圖

圖13.擇優取向引起的XRPD多峰圖

峰偏移經常發生在水合物脫水前後或者樣品熱處理前後的XRPD圖上。非化學計量比水合物與對應的無水晶型具有相似的晶體結構，隻有少數衍射峰有差異。脫水後，晶格收縮，晶麵間距減小，導致衍射峰右移。

同樣，溫度對於XRPD的位置也有影響。熱脹冷縮是一個物質的基本屬性，同樣適用於晶體。根據布拉格公式2d sin θ=n λ，溫度升高，晶體膨脹，在波長不變的情況下，晶麵間距d值增大，必然使sin θ 變小，即峰位左移。

另外，樣品受到擠壓，產生均勻的顆粒應變，比如壓片，亦可能導致峰位右移。具體如圖14和圖15所示。

圖14.水合物脫水引起的XRPD峰偏移圖

圖15.受熱和應力存在引起的XRPD峰偏移圖

在XRPD譜圖分析時，如果遇到峰裂分等情況時，可能是顆粒表麵粗糙度、顆粒太大、晶體結構缺陷等因素引起，研磨再測試可以解決大部分的問題。具體如圖16所示。

圖16.氯化鈉不同顆粒大小引起的XRPD峰分叉圖

05 hjc黄金城的技術和服務

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[1] 《中國藥典》(2020年版)中0451 X射線衍射法
[2] 〈941〉 CHARACTERIZATION OF CRYSTALLINE AND PARTIALLY CRYSTALLINE SOLIDS BY X-RAY POWDER DIFFRACTION (XRPD).
[3] PECHARSKY V K, ZAVALIJ P Y. Fundamentals of Powder Diffraction and Structural Character of Materials [M]. Spring-er, 2005:161.

美研|CMC係列回顧

❖ CMC係列(一)|淺談藥物研發中原料藥工藝研究的重要性

❖ CMC係列(二)|藥學研究之世界銀屑病日

❖ CMC係列(三)|高端吸入藥物的市場格局和研究現狀

❖ CMC係列(四)|淺談手性藥物的研究策略

❖ CMC係列(五)|藥物晶型控製策略

❖ CMC係列(六)|含氮類化合物-可揮發堿性有機胺的氣相分析

❖ CMC係列(七)|新藥研究中的固態開發挑戰及應對策略

❖ CMC係列(八)|淺析ICH指導原則Q3C及未收錄殘留溶劑限度製定方法

❖ CMC係列(九)|定量核磁應用及其方法驗證/定量核磁那些事兒

❖ CMC係列(十)|藥物雜質研究策略之基因毒性雜質

❖ CMC係列(十一)|手性化合物的拆分策略與經驗分享

❖ CMC係列(十二)|單晶結構解析在藥物開發中的應用和單晶培養哪些事兒