美研| CMC係列(十二)：單晶結構解析在藥物開發中的應用和單晶培養哪些事兒

開篇引言

X射線衍射單晶結構解析作為一種可以精確測定分子三維空間結構的首選方法，是現代化學研究中重要的技術手段之一，廣泛應用於化學、材料科學和生命科學等領域的研究。

1 單晶培養在藥物開發中的應用

化合物的結構決定化合物的物理化學性質，隻有充分了解化合物的結構，才能深入認識和理解化合物的性質，才能更好的指導我們藥物的研究與開發。

探尋物質結構的方法有很多種，比如元素分析、紫外吸收光譜（UV）、紅外吸收光譜（IR）、拉曼吸收光譜（Raman）、核磁共振譜（NMR）、高分辨質譜（HRMS）等，這些方法中，大部分都是基於物質對某些波長的電磁波的吸收或發射，這些均屬於波譜方法。人們就可以從這種吸收譜推導出物質的結構與性質方麵的信息。例如從核磁共振譜圖可以得到化學位移和耦合常數，通過這些信息可以推導出碳、氫等原子的數量、原子之間的相互關係等等。

不同的波譜方法可以得到各種有用的信息，然而，這些方法都無法準確給出分子的立體結構信息。

單晶X-射線結構分析是當前認識固態物質微觀結構的最有力的技術手段。隨著醫藥行業的發展，每年都有大量的新化合物被合成出來，這些化合物中，有相當部分不僅結構新穎，而且結構也越來越大越來越複雜，用其它波譜方法難以比較清楚、全麵地了解其空間結構。單晶結構分析可以提供一個化合物在固態中所有原子的精確空間位置，從而為化合物研究提供廣泛而重要的信息，包括分子、原子的連接形式、分子構象、鍵長和鍵角等數據。另外，還可以從中得到化合物的組成比例，對稱性、以及原子或分子在三維空間的排列、堆積方式。單晶結構分析是目前諸多固態物質結構分析方法中，可以提供信息最多、最常用的研究方法。

單晶結構解析在藥物開發中的主要應用如下：

❖ 確證化合物的立體結構：CDE頒布的《手性藥物質量控製研究技術指導原則》要求手性藥物，需要選擇合適的方式來證明該藥物的絕對構型。藥品審評中心在對該指導原則解讀文章中指出，單晶X射線衍射法是確證手性藥物構型（手性中心絕對構型）的首選方法，尤其在確證創新性藥物構型時，或當藥物中存在多個手性中心時，應盡可能通過各種辦法獲得該藥物的單晶樣品進行單晶X射線衍射測定；
❖ 確證化合物分子中雙鍵順反異構，環丁烷對位的順反異構、軸手性、特殊官能團的互變異構等；
❖ 確定原子的位置和連接形式；
❖ 確定化合物的化學組成以及比例：鹽型研究中，可以明確成鹽的摩爾比，成鹽位點，API和成鹽反離子之間是鍵合方式如成鹽還是成共晶。共晶篩選，亦是確證成共晶與否的主要技術手段等；
❖ 溶劑組成以及溶劑和API的結合方式：可以直接提供化合物是水合物還是某溶劑合物、溶劑的結合方式，是管道水合物還是隔離型水合物以及水的含量；
❖ 確定晶型的晶胞參數，提供晶型的標準XRPD譜圖。

2 什麽是好的晶體

晶體是內部一種原子、分子或離子在三維空間有規律地重複排列的固態物質。由於空間排列的規律性，可以把晶體中若幹個原子、分子或離子抽象為一個點，於是晶體可以看成空間點陣。如果整塊固體為一個空間點陣所貫穿，則稱為單晶體，簡稱單晶。好的單晶應該透明有光澤，表麵幹淨無裂痕（如下圖1），應該滿足以下基本條件：

❖ 內部結構高度有序、不存在晶格缺陷；
❖ 大小能夠滿足測試要求（有機物通常為0.1-0.3 mm）；
❖ 並不一定要形狀規則，但表麵需要光滑無裂紋；
❖ 不聚集或者少聚集，沒有明顯的雜質以及不會出現多個單晶重疊在一塊；
❖ 不容易風化，具有一定的穩定性。

圖1. 不同晶習的單晶

3 單晶培養方法

隻有培養出好的單晶，才能獲得理想的單晶X-射線衍射數據，而理想的單晶X射線衍射數據是結構解析的前提。常用的單晶生長方法有溶劑緩慢揮發法、冷卻結晶法、界麵擴散法、氣液擴散法等，如圖2所示。常用的單晶培養方法和注意事項，已經有大量的文獻報道，這裏不作詳細介紹，接下來主要就兩種新技術熔體微滴法和共結晶法做闡述。

圖2. 單晶的培養方法

A、熔體微滴法培養單晶：

將樣品部分熔融至剩餘單顆粒，降溫至 0.97–0.99Tm ，使得該單顆粒在熔融微滴中生長，該方法的高溫可避免二次成核和其他晶型的幹擾。

圖3. 熔體微滴生長單晶

B、共結晶法：

許多化合物不容易結晶，容易產生油、膠狀物、無定型等，當使用常規方法無法獲得單晶，或者目標化合物難於結晶，解決小分子化合物結晶問題的另外一種選擇是用較大的有機主體生產包合物。比如四芳基金剛烷（TAAS）很容易與小分子形成結晶包合物，用TDA或TBro進行熱結晶實驗。分析物和金剛烷的混合物在實驗室加熱板上加熱最多30秒，直到形成澄清的溶液，然後關閉加熱板，使溶液冷卻到室溫，晶體在幾分鍾或幾小時內形成。

圖4. 四芳基金剛烷結構

圖5. 通過與TDA和TBro共結晶獲得X晶體結構的化合物

4 hjc黄金城藥物固態開發技術平台

hjc黄金城藥物固態開發技術平台具有專業和經驗豐富的鹽型/共晶篩選、晶型篩選、單晶培養和結構解析、晶型定性定量研究團隊。目前累計完成單晶培養50個，成功培養出單晶超過40個，成功率達到80%以上，研究結果滿足藥物注冊申報研究要求，同時積極配合客戶完成審計及藥監部門的現場核查工作。

5 hjc黄金城案例分享

案例一 確定具有軸手性化合物的立體結構

項目背景：

1、化合物具有軸手性；
2、容易形成片狀晶體並團聚；
3、培養出適合的單晶後進行結構解析；
4、確定構型，交付單晶結構解析報告。

案例二 確定水合物的結合方式以及水的比列

項目背景：

1、某新藥API是水合物，但水的含量通過TGA和KF不好明確，客戶認為化合物是一水合物，項目組更趨向是半水合物；
2、通過單晶結構解析了解水的結合方式以及比列；
3、培養單晶，通過單晶結構解析確定了該水合物是半水合物，水分子處在晶體的隧道中，通過氫鍵連接。

參考文獻：

[1] 陳小明，蔡繼文.單晶結構分析原理與實踐第2版[M].北京：科學出版社，2007.
[2] 手性藥物質量控製研究技術指導原則.
[3] 指導原則解讀係列專題（十四）-手性藥物的合成工藝及結構確證.
[4] Ou X, Li X, Rong H, et al. A general method for cultivating single crystals from melt microdroplets[J]. Chemical Communications, 2020, 56, 9950-9953.
[5] Absolute Configuration of Small Molecules by Co-Crystallization Felix Krupp, Wolfgang Frey, Clemens RichertAngew. Chem. Int. Ed.,2020, DOI: 10.1002/anie.202004992.

美研|CMC係列回顧

❖ CMC係列(一)|淺談藥物研發中原料藥工藝研究的重要性

❖ CMC係列(二)|藥學研究之世界銀屑病日

❖ CMC係列(三)|高端吸入藥物的市場格局和研究現狀

❖ CMC係列(四)|淺談手性藥物的研究策略

❖ CMC係列(五)|藥物晶型控製策略

❖ CMC係列(六)|含氮類化合物-可揮發堿性有機胺的氣相分析

❖ CMC係列(七)|新藥研究中的固態開發挑戰及應對策略

❖ CMC係列(八)|淺析ICH指導原則Q3C及未收錄殘留溶劑限度製定方法

❖ CMC係列(九)|定量核磁應用及其方法驗證/定量核磁那些事兒

❖ CMC係列(十)|藥物雜質研究策略之基因毒性雜質

❖ CMC係列(十一)|手性化合物的拆分策略與經驗分享