細胞免疫功能檢測

2017-09-04

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T細胞增殖功能測定

基礎理論:本技術用於評估T細胞對各種刺激的增殖能力。T細胞增殖能力是反映T細胞功能的一個重要指標。

刺激T細胞增殖的因素及意義

1. 特異性抗原：引起寡克隆活化增殖。克用於判斷抗原免疫的效果（疫苗接種）和回憶反應能力，也能反映T細胞總體的功能。

2. 絲裂原：多克隆。

3. 刺激信號轉導分子：多克隆。

T細胞增殖測定方法

1. 顯微鏡下觀察細胞形態與細胞計數。

2. 放射性核素摻入試驗。

細胞增殖時，DNA複製，須從培養液中補充核苷酸。用放射性核素標記培養液中提供的胸腺嘧啶（3HTdR），當DNA複製時， 3HTdR摻入正在分裂的細胞的DNA中。細胞增殖程度與細胞內摻入的3HTdR的量成正比。通過用液閃儀定量測定培養細胞中的放射性強度，就可以確定T細胞增殖的能力與強度。

絲裂原誘導的增殖反應

誘導T細胞增殖反應的絲裂原

1. PHA（植物血凝素）

2. Con A（刀豆蛋白 A）

3. PMN（美洲商陸）

技術方法

1. 用RPMI－10將PBMC配成1x106/ml的懸液。

2. 用100g/ml的PHA配製1:10、1:20和1:40稀釋液。

3.96孔板中選擇一行（共12孔），每孔中加入100µl細胞。指定每相鄰3孔為一組。前3組分別加入一種稀釋度的PHA溶液，最後一組加培養液（對照組）。

4. 37°C ，5％CO2，54h。

5. 配製濃度為50µci/ml的3HTdR。

6. 每孔加入50µci 3HTdR，繼續培養18h。

7.用多孔自動收集儀分別收集每孔細胞於一小管中。溶解細胞，將DNA過濾到濾紙上，洗去未摻入的3HTdR，最後用100％的甲醇洗滌，以利濾紙幹燥。

8. 將濾紙放入液閃管內，自動計數，打印結果。

9. 扣除本底，計算每一組3個複本的平均數。

影響因素

1. 細胞活力：冷凍技術影響細胞活力，複蘇後應檢查細胞活力。

2. 培養液中添加的血清：有些血清可能激活或抑製細胞增殖。如欲測定人體細胞增殖能力，可采用滅活的AB血清。

3. 細胞培養板類型：根據細胞數量采用不同形狀底部的培養板。

4. 微生物汙染：可降低細胞增殖能力。

單向混合淋巴細胞培養反應

原理：T細胞受體能夠識別同種異型MHC分子。當把2個不同個體的單個核細胞在體外混合時，可以相互刺激，引起增殖。增殖的強度與兩者之間MHC的差別的程度成正比。所以同種異型混合淋巴細胞反應的強度反映2個個體之間MHC差別的程度，並且因為相互識別與增殖，結果是2個個體的淋巴細胞增殖能力的總和。這種試驗就是雙向混合淋巴細胞培養試驗。

將參加反應之一方的單個核細胞用放射性核素照射，使其失去反應能力，但仍保存刺激能力，成為刺激細胞，則此時的反應結果僅反映另一方（反應方）的增殖能力。在實質性器官移植時，隻需了解受者淋巴細胞對供者MHC的反應能力，所以適合采用單向混合淋巴細胞培養反應。

單向混合淋巴細胞培養試驗

方法

1. 分離宿主與供者的PBMC，調整細胞濃度為1 x 106/ml。

2. 刺激細胞滅活：用絲裂黴素（終濃度25µg，37 °C， 5％C，30min）或放射性核素照射（2000 rad）的方法處理刺激細胞。

3. 96孔板中，每孔加入1x105的刺激細胞和1x105反應細胞。 37°C，5％CO2，4～6d。加3HTdR，繼續培養18h。陽性對照孔加反應細胞和絲裂原，不加刺激細胞。陰性對照孔隻加照射的自身細胞。3複本。

4. 收集細胞，液閃儀計數，打印結果。

5. 計算相對反應（RR）

（實驗組cpm－陰性對照組cpm）

RR＝—————————————————

陽性對照組cpm－陰性對照組cpm

注意點

1. 細胞活力：使用冷凍細胞時，複蘇後應檢查細胞活力。

2. 培養液中添加的血清：有的血清可能會刺激或抑製反應。

3. 本底應小於2000 rpm，陽性對照組應大於20000 rpm。

抗原誘導的特異性增殖反應

原理:本試驗測定T細胞在體外對某一特定抗原的特異性免疫應答能力。所用抗原可以是初次接觸的抗原，也可以是曾經免疫過的抗原。常用的測定回憶反應的抗原有純化蛋白衍生物（PPD）和破傷風類毒素（TT）。這2種抗原都被常規列入計劃免疫接種範疇，成人應該對它們有回憶反應。在某些免疫缺陷病中，對它們的特異性回憶反應可減弱或消失。

方法（以T細胞對破傷風類毒素刺激的增殖反應為例）

1. 分離PBMC和APC，APC用絲裂黴素或放射性核素處理。

2. 96孔板中每孔加入1x105 PBMC和1x104 APC。

3. 每孔中加入係列稀釋的破傷風類毒素溶液，不同孔中抗原終濃度分別為0、1、5、10和20µg/ml。每一種濃度設3複本。

4. 37C°，5％CO2，6天。

5. 加3HTdR，繼續培養18小時，計數。

結果解釋

1. 對於接種過破傷風疫苗者來說，本試驗結果呈低反應反映患者對破傷風類毒素特異性應答能力低下或全身免疫缺陷。

2. HIV感染者反應低下反映CD4+T細胞減少導致的免疫缺陷。

注意點

1. 培養液中最好用人AB血清。

2. 此T細胞增殖反應需要APC。如使用純化T細胞，需加5％～10％自身APC。

B細胞產生抗體能力的測定

基礎理論:B細胞受到多克隆激活劑或特異性抗原刺激後，活化、增殖，最後分化成為漿細胞，產生抗體。抗體可以在血漿和其他體液中檢出，檢測抗體是測定B細胞功能的最重要的方法。B細胞分類：B1細胞和B2細胞。兩者發生學不同、接受刺激的抗原不同，對T細胞的依賴性不同。由於B2細胞對抗原的應答依賴T細胞，所以，B細胞產生抗體能力的低下，其缺陷也可能起源於T細胞缺陷。

絲裂原誘導多克隆抗體產生能力的測定

基礎理論:人B細胞具有PWM受體，在體外受到PWM刺激時，發生多克隆激活，產生多克隆抗體。B細胞產生抗體的能力可以用ELISA測定培養上清中抗體的量估計，也可以用ELISPOT方法測定產生抗體的B細胞數量估計。

技術方法與評價

1. 分離PBMC96孔板中每孔加入1x105細胞和PWM終濃度（1：100）。陰性對照孔內不加pWM。每一實驗設2 複本。

2. 37C°5％CO2培養10天（ELISA）或7天（ELISPOT）。

3. 收集上清，用ELISA法測抗體。收集細胞，用ELISPOT法測產生抗體的B細胞。

應用實踐

1. 用於確定B細胞活化和分化的信號轉導機製，以及細胞因子和其它銀子對B細胞分化的影響。

2. 因為B2細胞產生抗原需要T細胞輔助，所以又可以用於檢測T細胞的輔助功能。

3. 臨床上用於研究免疫缺陷病和自身免疫病患者B細胞分化異常的機製。

注意點:采用以抗體為基礎的技術（如磁珠法、淘洗法和流式細胞儀）分離的B細胞，需考慮抗體對B細胞產生抗體的影響（促進或抑製作用）。

ELISPOT法

基礎理論:ELISPOT全稱為酶聯免疫斑點試驗（enzyme－linked immunospot assay），可用於測定產生IgG和IgM抗體的B細胞。其方法是用抗原包被固相，然後加入抗原特異性B細胞。如果B細胞產生抗體，抗體與板上的抗原結合。加入酶標二抗和顯色劑就會顯色。一個斑點就代表一個產生抗體的細胞。

技術方法

1. 抗原包被：37C°2h，或4C°過夜。固相載體可用聚苯乙烯平皿、亞硝酸纖維膜、96孔板。

2. 抗體生成細胞培育：加入適量抗體生成細胞，37C°，5％CO2，3～4h，或過夜。洗滌，去除為與固相結合的細胞。

3. 測定斑點產生細胞：加二抗， 37C°，5％CO2，2～3h。加辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶和底物顯色。

4 計數：24h後用10～30倍顯微鏡下計數斑點形成細胞。

評價

1. 在操作中應使用無關抗原作陰性對照；病應排除細胞標本終抗體汙染。

2. 硝酸纖維素膜靈敏度高於聚苯乙烯。

3. 與ELISA聯合使用，可以估計單個細胞的抗體產量。

4 當淋巴細胞受到嚴重汙染時，也可以使用本法，所以適用於測定組織中抗體生成細胞。

應用實踐:用途同ELISA法。本方法可用於任何可溶性抗原。

ELISA測定各類免疫球蛋白

基礎理論:B細胞受抗原刺激後，最初產生IgM抗體，然後在Th細胞產生的各種細胞因子的作用下，可轉類成為IgG、IgA、IgE類抗體。應用不同的單抗，結合ELISA方法，可以測定B細胞產生的抗體的類別。

方法

1. 包板：96孔板用濃度為10µg/ml的特異性單抗包被。蓋上蓋板，37C°，5％CO2，2h，或4C°過夜。常規洗板，封閉。

2. 上樣：每孔內加入1:10或1:20 稀釋的細胞培養上清液100µl。陽性對照為標準品，陰性對照為培養液。每試驗設2複本。室溫培育2h，或4C°過夜。

3. 加酶標二抗：每孔加100µl堿性磷酸酶標記的羊抗人IgM或IgG或IgA二抗。室溫培育2h，或4C°過夜。

4. 顯色：洗板，每孔加100µl底物（p－nitrophenyl phosphate）。

5. 自動酶標儀讀數，從標準曲線讀出抗體濃度。

評價:ELISA法靈敏、簡單、快速、特異性高、重複性好，是測定上清和體液中Ig的首選方法。堿性磷酸酶標記的二抗顯色明顯，不必用堿中止反應，尤其適用於測定體外產生的抗體。

應用實踐:ELISA可測定各種體液中的抗體，其結果反映被檢個體B細胞功能。測定免疫球蛋白各種亞類的水平有助於鑒定免疫缺陷病。

CTL殺傷功能的測定

基礎理論:CTL為細胞毒性T淋巴細胞的簡稱。是CD8＋T細胞識別APC表麵MHCI類分子遞呈的腫瘤或病毒特異性抗原肽後，分化形成的。當CTL遇到相應的腫瘤細胞或病毒感染細胞時，能夠通過細胞接觸機製或裂解機製殺傷靶細胞。

1. 細胞接觸機製

CTL表達FasL，靶細胞表達Fas，FasL與Fas的配接，通過Fas傳入的信號激活靶細胞內細胞凋亡途徑，導致靶細胞死亡。

2. 細胞裂解機製

CTL激活後，胞質內顆粒向2個細胞接觸點移動。顆粒膜與細胞膜融合通過外吐釋放顆粒內容物。穿孔素插入靶細胞膜後聚合，喜愛細胞膜上形成孔，造成細胞裂解。顆粒酶誘導靶細胞凋亡。

51Cr標記法原理

如在將靶細胞與CTL混合之前，先用放射性核素51Cr培育，51Cr能穿過細胞膜進入胞漿，與胞漿中小分子蛋白質牢固結合，不能自由從細胞內釋放。當靶細胞膜被CTL破壞後，51Cr被釋放進入上清。因為上清中放射性強度與細胞殺傷程度呈正比，通過測定上清中放射性強度，就可以判定CTL殺傷能力。

技術方法

1. 從腫瘤組織中分離淋巴細胞和腫瘤細胞。

2. 51Cr標記腫瘤細胞。

3.96孔培養板每孔中加入淋巴細胞和靶細胞，效：靶比為50:1，25:1，12.5:1。另設最大釋放對照（靶細胞加去汙劑）和自發釋放對照（不加CTL）。

4. 37C°，5％CO2，4h。

5. 收集上清，計數器測定放射活性（cpm）。

NK細胞毒性測定

基礎理論:NK細胞存在於外周血、淋巴組織中，尤以脾髒最為豐富。因細胞體積大和胞漿內含大量顆粒，故稱大顆粒淋巴細胞。表型特征是CD16（FcRIII A）和CD56（神經細胞粘附分子）。當NK細胞識別腫瘤細胞活病毒感染細胞時，CD16分子被交聯，引起脫顆粒，並分泌IFN－和TNF。顆粒中含有穿孔素、顆粒酶和proteoglycans，引起靶細胞溶脹性死亡和凋亡。NK細胞的CD16與IgG1和IGg3結合，可介導ADCC作用。

NK細胞表達一種能識別HLA－A、－B、－C抗原的受體，向細胞發出一致性信號，阻止NK細胞的殺傷活性。當靶細胞不表達或低表達HLAI類分子時，抑製解除，NK細胞活化，殺傷靶細胞。

K562細胞係不表達HLA分子，對NK細胞殺傷作用敏感，常用作NK細胞的靶細胞，用於檢測NK細胞的活性。

技術方法

1. NK細胞的分離：用抗CD3、CD19、CD14單抗和淘洗法，去除T細胞、B細胞和Mo，獲取NK細胞。

2. 加板：方法同CTL殺傷試驗。不同的是，靶細胞為K562細胞。最大釋放組為靶細胞中加去汙劑，自發釋放對照組中不加Nk細胞。37C°，5％CO2，4h。

3. 收集上清液，計數器測各孔cpm值。

4. 計算％溶解值：方法同CTL法。

評價

1. 本方法穩定，但51Cr汙染環境。

2. 從外周血中分離的NK細胞是靜止細胞，隻能殺死對峙敏感的K562細胞係，不能殺傷其它腫瘤細胞。

3. 冷凍保存影響NK細胞活性，故宜采用新鮮分離的NK細胞。

4. 人血清中含有的IgG會抑製NK細胞的殺傷活性，故培養液中宜使用小牛血清。