細菌內毒素檢測

細菌內毒素檢查法（凝膠法）實驗程序

• 1. 實驗準備：試劑耗材及器具等
  hjc黄金城使用的相關內毒素檢測試劑耗材及器具都是經過嚴格的供應商篩選並采購，市麵上公認的且符合要求的相關試劑和器具，如湛江安度斯品牌的內毒素標準品、鱟試劑和檢查用水等。
  
  2. 確定藥品的細菌內毒素限值（L）
  產品的細菌內毒素限值一般是通過公式L=K/M計算得到的。其中M為人用每千克體重每小時最大供試品劑量，可參考藥品說明書或具有權威性資料的用法用量。hjc黄金城專業團隊也可提供相關技術指導並結合預篩選試驗結果幫助客戶快速準確製定相關限度標準。
  3. 計算供試品的最大有效稀釋倍數（MVD）或最低有效濃度（MVC）
  4. 複核鱟試劑靈敏度
  5. 藥品與鱟試劑相容性的初篩試驗
  6. 供試品幹擾試驗以及幹擾試驗的驗證
  凝膠法係利用細菌內毒素與鱟試劑反應可形成凝膠的原理，來測定供試品中的內毒素含量是否符合規定。反應過程中會受到很多因素的影響，經常存在幹擾問題。例如來自樣品中的主成分、輔劑、甚至一些雜質等。大部分的幹擾作用都可以通過使用細菌內毒素檢查用水稀釋供試品的方法排除。當有些幹擾作用僅使用稀釋法不能排除時，可采用其他方法消除幹擾因素，然後再進行試驗。
  基於文獻和實踐經驗案例等，hjc黄金城整理出一套完善的各類幹擾因素和對應的排除方法，能夠實現快速精準排除幹擾並進行驗證試驗。
  幹擾因素和排除方法匯總表

  幹擾因素	排除方法
  pH值的幹擾	調節pH值至6.0~8.0
  二價陽離子濃度不足造成的幹擾	添加適量Ca2+、Mg2+離子緩衝液
  內毒素聚集造成的幹擾	定期渦旋，配製前渦旋
  高濃度鹽或糖的幹擾	稀釋或使用適當超濾設備
  脂質體的幹擾	加內毒素分散劑
  內毒素吸附的幹擾	首選硼矽酸鹽玻璃的稀釋管、反應管、刻度吸管，一次性器具應選擇聚苯乙烯
  表麵活性劑的幹擾	試驗用生理鹽水稀釋供試品，生理鹽水可使供試品鹽化，從而降低其表麵活性
  酶、酶抑製劑帶來的幹擾	將供試品適當加熱使酶失活
  葡聚糖的幹擾	使用抗增液複溶鱟試劑

  7. 供試品日常的內毒素限量檢查。
  8. 可疑結果處理程序

  實驗人員首先對實驗項目進行回顧：檢驗用標準、檢驗操作、記錄和計算、儀器狀態、.標準物質、試劑質量、其他異常現象（是否有可能存在汙染，環境、器械等）複核人員進行複核:若發現檢驗人員檢驗過程存在異常，複核人員以正確的檢驗過程重複實驗一次，以取代最初的實驗結果。若未發現檢驗人員檢驗過程存在異常，為了確定不合格結果是否由測試或分析誤差原因造成，複核人員可重複實驗。定量試驗提供數據參考不同鱟試劑的使用

案例

• 背景：脂質體輔料工藝研發和生產項目，由於限度，客戶對於內毒素檢測的方法始終沒有開發成功，如上所說，內毒素檢測中因工藝引入或產品本身存在的一些幹擾因素，在稀釋到產品最大有效稀釋倍數的情況下仍然不能排除幹擾，抑製內毒素和鱟試劑的反應導致供試品陽性對照組檢測為陰性。
  hjc黄金城微生物團隊通過一整套相關幹擾因素的排除，基於工藝步驟結合以往經驗在短時間內開發出能夠排除眾多幹擾因素的產品前處理方法。
  1. 脂質體水溶性差
  脂多糖的兩親性會使其對一些具有疏水基團的產品具有親和力，脂多糖與這些產品的結合會使其大小和形狀受到影響，以至於影響活性，使內毒素試驗受到幹擾，形成抑製。 通過加入適量內毒素分散劑使產品中的內毒素分離出來，可恢複內毒素的活性。
  2. 螯合劑幹擾
  工藝中引入的試劑含有螯合劑成分會螯合鱟試劑中的二價陽離子（如Mg²⁺離子）從而造成而家陽離子不足造成抑製。同時加入適量Mg²⁺離子緩衝液，排除工藝引入的相關螯合劑導致二價陽離子不足的幹擾，從而使內毒素正常激活鱟試劑的酶反應。
  綜上排除多種因素幹擾，在允許的最大稀釋倍數濃度下順利通過幹擾實驗的驗證並完成限量檢查。幫助客戶在短周期內實現快速交付。
• 注：
  參考安度斯相關資料
  中國藥典2020版四部通則1143 細菌內毒素檢查法及
  中國藥典2020版四部通則9251 細菌內毒素檢查法應用指導原則

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