蛋白質免疫印跡實驗

上海hjc黄金城的生物部在體外生物學領域有豐富廣泛的經驗，通過酶水平測定、細胞水平測定、細胞生物學、生物化學、體外同位素測定、穩定細胞株建立、基因敲除、RNAi和MicroRNA技術等，提供一套完整的生物學服務。

在細胞生物學研究中，有時要對細胞膜分子、胞內分子或表達產物進行定性或／和定量。但由於靶蛋白表達水乎不太高，用細胞裂解液或表達上清進行SDS-PAGE電泳、免疫印跡（Western blot）檢測很難達到實驗目的。為此可用特異性識別靶蛋白的抗體進行免疫沉澱，純化和富集靶抗原。免疫沉澱所獲得的蛋白可進行SDS－PAGE電泳，經考馬氏亮藍染色或銀染後觀察目的蛋白條帶。如果免疫沉澱得到的目的蛋白量低於考馬氏亮藍染色或銀染的檢測下限，可采用 Western blot檢測方法，提高檢測的靈敏度，達到實驗目的。

免疫印跡(immunoblotting)又稱蛋白質印跡(westernblot)，它是根據抗原抗體的特異性結合檢測複雜樣品中的某種蛋白的方法。western blot是在凝膠電泳和固相免疫測定技術基礎上發展起來的一種新的免疫生化技術。由於免疫印跡具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫測定的高特異性和敏感性，現已成為蛋白分析的一種常規技術。免疫印跡常用於鑒定某種蛋白，並能對蛋白進行定性和半定量分析。

免疫印跡法分三個階段進行。
第一階段為SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）：抗原等蛋白樣品經SDS處理後帶陰電荷，在聚丙烯酰胺凝膠中從陰極向陽極泳動，分子量越小，泳動速度就越快。此階段分離效果肉眼不可見（隻有在染色後才顯出電泳區帶）。
第二階段為電轉移：將在凝膠中已經分離的條帶轉移至硝酸纖維素膜上，選用低電壓（100V）和大電流（1～2A），通電45min轉移即可完成。此階段分離的蛋白質條帶肉眼仍不可見。第三階段為酶免疫定位：將印有蛋白質條帶的硝酸纖維素膜（相當於包被了抗原的固相載體）依次與特異性抗體和酶標第二抗體作用後，加入能形成不溶性顯色物的酶反應底物，使區帶染色。
 

一、蛋白免疫實驗原理 

印跡法：將生物大分子物質通過不同的途徑轉移到固相載體上，轉移後的固相載體經淬滅試劑處理後，用適當的溶液漂洗，置於含底物或探針的溶液中孵育，可與對於的探針反應，顯出特異條帶。
常見的印記法有Southern、Northern、Western印跡法，分別用於檢測DNA、RNA和蛋白質。其中Western印記又稱為免疫印跡。
其中，免疫印跡的基本原理是將凝膠電泳與固相免疫相結合，其主要的操作分為三個過程：
1)電泳：SDS-PAGE分離各蛋白組分；
2)印記：將蛋白質從凝膠轉移到固相載體；
3)免疫檢測：依次與一級抗體和標記的二抗體反應，通過底物或激發光激發顯色，觀察目的條帶的有無。

Western Blotting 是用來檢測蛋白質的一種技術。
首先將含有待測蛋白的蛋白質混合物進行凝膠電泳分離，然後將已經分離的蛋白質通過電泳技術從凝膠轉移到固體支持物上，這一固體支持物目前常為硝酸纖維素薄膜。隨後以待測蛋白質上抗原決定簇特異性的抗體（稱為第一抗體）為探針，與固體支持物上的蛋白質進行免疫反應，最後用偶聯有辣根過氧化物酶或堿性磷酸酯酶的抗第一抗體的抗體（第二抗體）與第一抗體進行免疫反應，隻有與第一抗體特異性結合的待測蛋白才能與第二抗體發生免疫反應。在有辣根過氧化物酶的底物用顯色劑存在時就會出現顏色反應，結合有第一抗體、第二抗體的待測蛋白，通過顏色反應即能顯現出來。
電泳將蛋白質從凝膠轉移到固體支持物上是通過電轉移儀器完成的。它是將固體支持物麵對陽極、凝膠麵對陰極，二者結合在一起，然後將外麵二側用Whatman 3MM濾紙結合，形成“三明治”結構，放入電轉移儀器上，加入電泳緩衝液，通上電源後，蛋白質即可從凝膠上轉移到固體支持物上。

二、蛋白免疫操作步驟

1、蛋白質電轉移
戴上手套，取下SDS-PAGE凝膠，小心剝離凝膠。裁剪與凝膠同樣大的硝酸纖維素薄膜和六層Whatman 3MM濾紙，在硝酸纖維素薄膜左下角剪去一角作為標記。將硝酸纖維素薄膜漂浮於去離子水的表麵，使水從膜的下部浸透以去除其間氣泡，將Whatman 3MM濾紙在電轉移緩衝液中浸濕，用蒸餾水淋洗石墨電極，先將三層浸濕的濾紙放在陽極上，在濾紙表麵滾動玻璃棒以除去其間的氣泡，再將浸濕的硝酸纖維素薄膜小心平鋪在濾紙上，用玻璃棒小心去除氣泡。隨後將12%SDS-PAGE凝膠舒展平鋪在硝酸纖維素薄膜上，用玻璃棒小心去除氣泡，再將三層浸濕的濾紙平鋪在凝膠上，沁心去除氣泡，最後加上石墨電極板，接通電源進行電轉移，電流的大小由凝膠的大小決定，為0.65mA/平方厘米。電轉移2小時後，停止通電，卸掉電轉移裝置，取下凝膠進行考馬斯亮蘭染色，以檢測電轉移是否完全。小心取下硝酸纖維素薄膜，放在一張幹濾紙上，吸幹30-60分鍾後，開始進顯色反應。
2、顯色反應
首先進行分子量標記的氨基黑染色。切下轉有分子量標記的硝酸纖維素薄膜，用含有0.3%吐溫20的PBS緩衝液漂洗三次後（每次15分鍾），再將其浸入氨基黑染液中，室溫染色5分鍾，然後置於氨基黑脫色液中脫去背景，水中漂洗後景幹備用。
轉有樣品的硝酸纖維素薄膜用含有5%脫脂牛奶的PBS緩衝液在室溫下封閉2小時，同時1：100加入兔抗GST第一抗體，平緩搖動，室溫保溫1小時。然後用PBS緩衝液將硝酸纖維素薄膜漂洗4次，每次  30分鍾。將辣根過氧分物酶標記的羊抗兔免疫球蛋白第二抗 體用封閉液稀釋50倍後，加入吐溫20至終濃度為0.05%，然後與上述漂洗的硝酸纖維素薄膜進行反應，將膜浸於其中，平放在平緩搖動的搖床平台上，室溫溫育  1小時後，用PBS緩衝液將硝酸纖維素薄膜漂洗4次，每次5分鍾，再加入4-氯萘酚顯色液，加入 5μ1 的30%H2O2，將硝酸纖維素薄膜置於其中緩慢搖動，待所檢測的蛋白帶顯色達到最深程度後，將硝酸纖維素薄膜轉入 PBS 溶液中停止顯色反應。取出硝酸纖維素薄膜，自然晾幹後拍照保存結果。

三、免疫印跡技術的注意事項

1、免疫印跡技術所測定的隻是目的蛋白的相對含量。因此不能確定一種細胞含有多少目的蛋白，隻能確定該蛋白存在與否及其它條件下與其他細胞相比蛋白的含量是高還是低。
2、比較一種目的蛋白在不同細胞或者同一細胞不同條件下的相對含量時，各樣平的總蛋白量必須相等。
3、選用合適的 SDS-PAGE 膠濃度，使目的蛋白可以得到較好的分辨。
4、開始電泳和轉移欠，一定要確認電極的正負極接頭是否正確。
5、在免疫檢測中，要注意封閉非特異性結合位點。
6、抗體反應在封口塑料袋內進行，一定要取出袋內的所有旗袍，否則會導致抗體結合不均勻。
7、操作要輕柔，帶手套，不要再轉移抹上造成任何刮痕。在整個操作中，轉移膜要始終在液體中，不能幹燥。 

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