編者引言
ELISA這項經典技術已擁有多年的發展曆史，有多種方法類型，競爭性ELISA技術就是其中一個基本類型，它同夾心ELISA法技術一樣，也被應用到藥物PK分析研究中；如何基於競爭性ELISA原理構建好一個競爭性 Assay並在方法建立實踐中把握好相關要點，對整個方法的最終成功尤為重要。作者結合自身實踐體會與案例以此文略作闡述，供大家參考。
ELISA技術自從上世紀70年代提出以來，經過幾十年的發展，業已成為生物醫藥研發領域不可或缺的經典技術。ELISA方法有各種不同類型的分類形式，基於反應原理和模式可主要分為直接法、間接法、夾心法及競爭法，其它基於不同的分子標記形式、載體形式、捕獲形式或信號產生形式等等的方法如熒光法、化學發光法、電化學發光法、類芯片法、微球法都是這4種基本方法的組合或衍生；其中，夾心法在大分子藥物如抗體、蛋白藥物的PK分析領域裏得到了廣泛應用。而對於小分子化合物或分子量偏小的多肽藥物，除了LC-MS/MS可進行它們的PK分析外，競爭性ELISA方法也可以發揮其特有的應用價值和優勢。不僅如此，即使是分子量較大的蛋白及抗體在實踐中也仍然可以考慮采用競爭性ELISA法進行相關的PK分析。因此，從可被應用的藥物分子類型廣度看，競爭法是在藥物PK分析領域中最具使用潛能的一種ELISA方法。
迄今數量繁多的現代藥物中，小分子藥物占據著絕大多數，許多小分子化合物是不具免疫原性但具免疫反應性的半抗原，如常與大分子抗體偶聯的作為ADC的Payload的細胞毒素，部分激素等。多肽也是現代藥物中舉足輕重的一部分，例如常見部分激素藥物為多肽，另如腫瘤新生抗原肽近年還成為藥物開發的一個熱點。多肽分子量相對於化合物而言比較大，相對於抗體、重組蛋白或融合蛋白，其分子量則又很小，往往缺乏較為複雜的二級結構或空間結構等，免疫原性較弱，是類半抗原物質。這些半抗原或類半抗原分子在理論上自身單獨不能或難以刺激機體產生抗體，但在偶聯了載體抗原分子後再免疫動物可以製備出與該分子本身進行結合反應的抗體，從而為構建對其進行ELISA測定的方法提供工具性試劑。
這些半抗原分子很小，往往其實僅有一個表位，不能形成不同位點與抗體結合的夾心之式；即使有的類半抗原多肽可能會存在兩個或以上的表位，但抗體製備中的現實是常很難獲得針對不同表位可以構成夾心配對使用的抗體，此種情況下，選擇構建競爭性ELISA方法則是一個因材施措的策略。有些分子量足較大、足夠複雜的含有多個表位的具完全抗原性的分子，如在僅一株單抗或僅有其多抗可被利用的實際條件下，也需考慮選擇設計競爭性的檢測方法；當然，對於具備條件采用夾心法檢測的完全免抗原性抗體或蛋白分子，有的情況下相關研究人員仍考慮使用競爭性ELISA方法進行測定也不是未嚐不可。
如何基於自己可利用的抗體試劑實際情況、所在實驗室具體的平台條件，綜合評估目標研究的試驗設計，基於競爭性ELISA原理成功建立一個 “Fit-for-Purpose”的分析方法，也是臨床前和臨床PK或PK/PD評價研究中一個具體又現實的技術性問題。
競爭性ELISA原理用於藥物PK定量分析的方法學設計策略
用於定量分析藥物PK濃度的競爭性ELISA方法通常有兩種基本的Assay構建模式，一種模式是以單抗或多抗作為固相捕獲試劑，樣品中遊離（本文中遊離特指非固相化）藥物與標記藥物競爭結合固相的抗體，如遊離藥物和生物素標記的藥物競爭性結合包被在板孔的抗體（參見圖1）。另一種模式就是將一定濃度的藥物包被在固相載體上，采用樣品中遊離藥物與固相藥物競爭性結合遊離的抗體（若圖2）。這兩種Assay模式在抗體藥PK分析的應用上也可以轉化為遊離藥物與標記藥物競爭它們固相的靶點分子，或遊離藥物與固相藥物競爭性結合標記的靶點分子；對於有的藥物也還可以轉化為對其受體分子的競爭性結合。具體設計時可以基於此兩種Assay模式進行衍生或轉化。
圖1 遊離藥物與標記藥物競爭的Assay模式
圖2 遊離藥物與固相藥物競爭的Assay模式
基於藥物與標記藥物競爭的這一模式，藥物分子可以用辣根過氧化物酶（HRP）或堿性磷酸酶（AP）直接標記，這樣的標記的藥物主要用於對靈敏度要求不高且基於傳統可見光吸收法檢測平台的競爭性Assay開發。基於傳統光吸收檢測平台也可以采用生物素標記，借助鏈黴親和素-生物素信號放大係統進行較高靈敏度Assay的構建。隨著分子標記技術的發展和新平台的不斷出現，如若需要開發更為靈敏的競爭性Assay，也可以采用熒光素標記藥物分子建立熒光檢測的方法，或可采用鑭係元素中的Eu(銪)標記藥物基於時間分辨熒光平台進行檢測，如有MSD平台的分析實驗室還可以利用該公司的SULFO-TAG標記藥物分子開發電化學發光的檢測方法。采用標記藥物和非標記藥物競爭的模式，選擇什麽樣的標記分子，產生什麽類型的信號，可以基於自身實驗室平台條件或儀器所擁有的檢測功能模塊和實際需要的靈敏度及標記的可行性情況實施具體的策略。
采用遊離藥物與固相藥物競爭的模式時，一個優勢是通常可以免除進行分子標記的麻煩，節約了標記成本，特別是當標記缺乏可行性時，如有些藥物分子缺乏與標記物相結合的基團或藥物分子被標記後其本身的穩定性或其它基團受到了影響的情況下采用此種競爭法是一種很好的應對策略。然而，有時實踐中我們會發現藥物直接包被在固相載體上限製了其與非固相抗體的有效結合，Assay的整體信號不容易上去，靈敏度難得到提高等現象，可能是固相化後其表位受到了影響。然而，將非標記的藥物直接固相化改造為間接固相化，這種結合反應被影響的情況有時會得到改善，如在標記可行的情況下，先將藥物進行生物素標記，使生物素標記的藥物與固相載體上包被的Streptavidin結合間接實現藥物固相化再與遊離藥物競爭（參見圖3）。分析人員可以自行包被Streptavidin，也可以購買商業化的包被有Streptavidin材料直接利用，如Thermo和MSD等公司均有商業化的Streptavidin Coated Plate提供。
圖3 遊離藥物與間接固相化藥物競爭的Assay模式
分析方法學模式的構建要結合具體實驗室的平台條件、可供利用的抗體情況、藥物分子的結構與性質、目標研究對靈敏度和方法檢測範圍的適用性要求等因素來製定具體策略。
競爭性ELISA原理應用於藥物PK分析方法學建立的實踐性要點
競爭性反應體係的構成
競爭性Assay的一個核心原理就是“競爭”，因此實踐此類方法建立的核心要點就是具有競爭性特征的抗原抗體反應體係的構成，即是要營造一個能促成“競爭”產生的ELISA反應係統。上述兩種基本的競爭性ELISA Assay Format，都由三個主要成分構成，即：遊離藥物、標記藥物或固相化藥物、抗體。這三大主要成分，我們可以分別把其概念化為：競爭因子、被競爭因子、資源因子。這三大因子是構成競爭性環境即反應體係的必需。標記藥物或固相化於載體的藥物在反應體係中濃度是固定的；而樣品中遊離藥物濃度是非固定的，特別是PK定量分析方法中要用到標準曲線，被測樣品中遊離藥物與構成標準曲線的不同濃度梯度的遊離藥物都是要與標記藥物或固相化於載體的藥物競爭性結合體係中的抗體，因此反應體係中抗體可以說是競爭性Assay中的“資源因子”；遊離藥物與標記藥物或固相化於載體的藥物互為競爭和被競爭的關係，為便於闡述，此文中我們把遊離藥物稱為“競爭因子”、標記藥物或固相化於載體的藥物稱為“被競爭因子”，其實兩者互為彼此的競爭因子。
營造競爭性反應體係的基礎
在微觀世界裏的一些分子間的相互影響或作用其實與宏觀世界甚至人類世界裏的現象是具有共通的地方，在某種資源有限的情況下，人與人間就會發生對該有限資源的爭搶即競爭性地占有資源。同樣，競爭性Assay反應係統中競爭因子與被競爭因子間的競爭關係發生基礎就是“資源有限”，對於競爭性ELISA而言就是抗體有限或具體說抗體所含的藥物總結合位點有限。如果抗體量過多或所謂飽和，則不能造成遊離藥物與標記藥物或固相化藥物的競爭，這樣的競爭性ELISA反應係統則是失靈的。
表1和圖4為一個正在建立中的某低分子藥物的競爭性ELISA PK Assay案例（案例一），根據給藥劑量、方式等預測需要開發一個定量範圍在0.391-25ng/mL的分析方法，采用的是固相藥物和遊離藥物競爭性結合其單克隆抗體的模式。同一批配製來源的標準曲線，當抗體濃度（此處以實際使用時的稀釋倍數顯示）非常高時（1/500），不同濃度的標準品的信號值無梯度性變化和明顯差異，此情況下，抗體濃度過高沒有造成遊離藥物競爭幹擾掉固相藥物與抗體的結合而不能使信號呈濃度梯度依賴性的差異變化。其它條件都相同時，降低單抗稀釋倍數到1:2000，標曲高濃度點間不同濃度梯度的標準品的信號值差異開始明顯呈現，預示競爭產生；當繼續降低單抗稀釋倍數至1:5000，這種濃度梯度依賴性的信號差異則更為顯著，標曲擬合趨勢向好。
表1：案例一中調節固相化抗體濃度後對方法表現的影響
圖4:表1對應的3個不同條件下的標準曲線
競爭因子間的調控
對於一個競爭性ELISA Assay而言，除了僅提供有限的“資源因子”，還需考慮到“競爭因子”與“被競爭因子”間的勢力大小問題，即互為競爭對象的兩者間不能出現競爭絕對勢力方。絕對勢力方會因其絕對優勢而導致對應的競爭方毫無對其幹擾的能力。對於這一點人類世界的現象和微觀世界的現象同樣是相通的。如兩個勢均力敵的人搏鬥時可以僵持很久，當一個人與兩個人同時搏鬥時也可能會堅持一段時間，當一個人同十幾個人同時搏鬥時因為力量對比懸殊，毫無對抗能力可言，極易瞬間被對方擊潰，甚至連出招抵抗的機會都沒有。競爭性ELISA方法建立時，如果作為被競爭因子的固相化藥物或標記藥物比例或濃度過高，則導致作為“競爭因子”的遊離藥物不會或幾乎不會對被競爭因子與抗體結合的幹擾，標準曲線的不同濃度標準品間的信號梯度不能出現或不顯著，標準曲線難以擬合或擬合質量不高而不具備較好的對未知樣品的測量分辨力，進而影響對實際的樣品真實準確定量。因此，實踐中客服這一問題時要注意參與反應的競爭因子間比例調控。
觀察競爭性因子的競爭能力，可以通過將樣品信號值歸一化為結合百分比（B/B0）來觀察,則競爭因子幹擾被競爭因子與抗體結合能力更顯直觀。實踐中常見的就是僅在幾個高濃度標曲點上出現了結合百分比的梯度依賴性差異，低濃度點的B/B0無顯著差異或幾乎不變，即低濃度標準品不能很好地參與標曲擬合，此種情況下一般是被競爭性因子相對於低濃度遊離藥物而言仍占據了絕對優勢，從而影響了方法的檢測靈敏度，可以嚐試調低被競爭因子的使用濃度或比例。如表2和圖5所示案例二：該方法為一個抗體藥物的競爭性ELISA方法，Assay Format為遊離藥物與生物素標記藥物競爭其抗獨特型抗體，同一批配製來源的標曲，在生物素標記藥物稀釋比例為1/30000時，幾個高濃度標曲點上出現了結合百分比的濃度梯度依賴性差異，但低濃度水平的標準品B/B0幾乎無差異，標曲低濃度端趨平緩，擬合不理想，其低濃度質控品的準確度也受到影響；當生物素標記藥物稀釋比例為1/40000時，低濃度水平的標準品B/B0差異顯著，標曲得到了很好擬合，來自於同一配製的低濃度質控品的準確度也趨好。
表2：案例二中不同生物素標記藥物比例下的方法表現的比較
圖5:表2對應的2個不同條件下的標準曲線
平衡性競爭體係與非平衡性競爭體係的應用
在社會生活中，我們經常聽說不對等競爭或不公平競爭。競爭性ELISA Assay同樣可以有對等的競爭和不對等的競爭，此文將其概念化為平衡競爭法和非平衡競爭法。平衡競爭法中是同步開啟“競爭因子”與“被競爭因子”對“資源因子”如抗體的結合反應，在標記藥物與非標記藥物的競爭性Assay Format中，將標記藥物與非標記藥物同步或幾乎無時差性加入到已包被有抗體的固相載體中實現平衡的競爭；在遊離藥物與固相藥物的競爭性Assay Format中，先將含遊離藥物的樣品加入已包被藥物的固相載體中，再行加入抗體實現平衡的競爭。反之，非平衡競爭法中則是非同步開啟“競爭因子”與“被競爭因子”對“資源因子”如抗體的結合反應；在標記藥物與非標記藥物的競爭性Assay Format中，可以先將標記藥物或非標記藥物加入到已包被有抗體的固相載體中，反應一段時間後再加入另一非標記藥物或標記藥物實現非平衡式競爭；在遊離藥物與固相藥物的競爭性AssayFormat中，先將含遊離藥物的樣品與抗體在單獨的載體中混合反應一段時間後，再加入到已包被藥物的固相載體中，或先將抗體加入到已包被藥物的固相載體上，反應一段時間後，再將含遊離藥物的樣品加入其中參與反應實現非平衡式競爭。一般來說，研究人員習慣於平衡性競爭法的操作流程，但有的情況下采取非平衡的競爭法，有利於Assay性能的優化。
如表3和圖6中的案例三，采用的是固相抗原和遊離抗原競爭性結合抗體的模式定量檢測某多肽藥物，此例中的標曲與QC也來源於同一批配製。其它條件都相同的前提下，當將遊離藥物與抗體先混合一起反應一段時間後加入包被有藥物的微孔板中，則該分析方法的表現要比先將遊離藥物加入包被有藥物的微孔板中再立即加入抗體的平衡性競爭方式好很多。非平衡性競爭法中的標曲低濃度點間的B/B0間差異更為顯著，標準曲線擬合質量更佳，QC的準確度可靠，而非平衡性競爭中不僅標曲低濃度端平緩，同樣來源的QC也表現不佳。
表3 案例三中平衡性競爭與非平衡性競爭的比較
圖6:表3對應的2個不同條件下的標準曲線
結語
綜上所述，競爭性ELISA法用於PK定量分析是相對較難的一種方法，具體實踐中若要利用好這一方法，始終要基於“競爭”這一根本原理展開反應體係的構建與優化。由於分子間的競爭與相互作用，都是肉眼無法看到的微觀世界裏的行為，將宏觀世界或說人類世界的現象發散到對微觀世界中個體間關係和作用的想象與思考中，未免不是一個借鑒性思維方式。同人類世界相似，實踐中無論是基於哪種競爭性分析模式，首先要營造好競爭性的環境，即提供有限的資源引發競爭；還要促進差異化的“競爭”效果的產生，對於競爭性ELISA方法，競爭性因子間無需勢均力敵，但要防止具有絕對優勢的競爭因子出現。為便於闡述，上述內容主要基於傳統的競爭ELISA檢測模式進行了舉例和闡述，文中這些實踐性的策略和要點可以結合一些新的平台進行衍生和優化使用，並也可以拓展到對內源性分子的檢測中，筆者的實驗室都有著各種衍生性的競爭性ELISA方法的具體實踐，原理相通，不再一一舉例。此外，作為PK定量的ELISA方法同常用到的其它PK定量法一樣，方法建立後也需要進行各種後續參數的優化與驗證，已有很多相關文獻闡述，因此本文不再贅述，把握好本文提出的策略和要點，將會為後續各參數的順利優化和驗證奠定一個良好基礎。
（未經許可，文章內的所有圖片和數據不得引用）
作者簡介
章登吉，本碩博分別就讀於安徽師範大學、上海師範大學&中國農業科學院上海獸醫所和複旦大學，主攻方向為大分子藥物與細胞基因治療藥物的分析與評價。曾任職上海藥明康德大分子生物分析部多年，加入hjc黄金城後創建了生物技術藥物分析團隊，現為hjc黄金城普亞生物技術藥物生物分析部門負責人，具有13年多的臨床和臨床前生物技術藥物分析經驗，負責過Novartis, Pfizer, Lilly, J&J, Genentech, Medimmune, Takeda，石藥集團等多家醫藥企業的多類型生物藥相關分析評價工作。在生物技術藥的藥代動力學、毒代動力學、免疫原性及生物標誌物相關的分析方麵有著豐富的理論基礎和實踐經驗，撰寫相關文章多篇，作為第一發明人申請相關國家發明專利五項，有三項已經獲得授權。
實驗室簡介
hjc黄金城生物技術藥物的生物分析實驗室擁有SpectraMaxM4/M5/i3x, MSD S600, Luminex, Biacore 8K, Envision, Gyrolab，Covaris E220R， ABI7500 qPCR儀等全方位多功能的技術平台，提供全麵符合FDA/CFDA GLP，GCP規範的生物技術藥物生物分析服務，以支持蛋白藥物、抗體藥物、ADC藥物、多肽藥物、核酸藥物、細胞基因治療藥物的早期篩選與開發，及其臨床前和臨床相關研究。
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