新藥發現階段高通量ADME研究

在最近的十幾年內，藥物的發現和開發的周期越來越長、試驗花費越來越多。在西方國家，開發上市1個新化合物實體需要10～15年的時間，花費超過8億美元。10000個新化合物實體中，有10個進入臨床階段研究，但隻有一個候選藥物最終能夠上市。即使已經上市的藥物也存在因不能接受的藥物不良反應而撤市的可能。因此新藥研發是一種“高風險、低效率的過程”。 對於創新藥物的研發，其過程由3個階段、4個步驟組成：

①靶位的發現、特性與評價(生物靶標階段)；
②先導化合物的發現和優化(藥物發現階段)；
③ADMET(吸收、分布、代謝、排泄和毒性)、PK、PD研究(藥物發現和開發階段)；
④臨床試驗(藥物開發階段)。

為了使更多藥物上市，可以采取兩個措施：一是提高篩選化合物的數量，這受到各種條件的限製，如經費、時間、資源、規模的限製；二是提高研發的成功率，如采取合理藥物設計、藥物發現階段的ADMET研究等。顯然提高研發的成功率更受研發單位的青睞。在1990年進行的回顧性研究中，發現之前在臨床階段失敗的候選藥物裏約40％是由藥代動力學方麵的原因造成的。製藥界已經認識到，對於具有靶位活性和選擇性的候選藥物，如果其ADME特性達不到類藥性要求，則這個候選藥物同樣不能最終成為藥物。為此新藥研究者將藥物發現後期的ADME研究提前到藥物發現早期階段，使不符合類藥性的化合物及早被淘汰，提高研發的成功率。經過數十年的研究，2000年的統計結果顯示，在臨床階段失敗的藥物中，因PK原因而淘汰的比例已經大大下降。
在藥物發現階段開展ADME研究，麵臨的問題是需要測試的化合物種類龐大(這得益於組合化學和平行合成技術的發展)、所需試驗的項目多，而每個化合物的量卻很少。這需要對已有的測試方法進行微量化、自動化和高通量改進，使化合物的測試速度與組合化學的合成速度相匹配。此外，在實驗流程設計上，為加快新藥研發的速度而采用平行(parallel)操作的方法，將相關的研究同時進行。以往多采取順序(serial)研究的方法，即完成一項試驗後再進行下一項，其效率很低。未來的方法是開展虛擬庫篩選結合平行操作，利用所建立的構效關係，在不合成化合物的情況下，對虛擬的化合物庫進行篩選，從而大大節省資源、加快藥物發現的速度。
在藥物研發階段，開展的ADME研究有：虛擬方法(in silico)或稱計算方法(computational method)；體外方法(in vitro)；體內方法(in vivo)。這3種方法各有其優缺點。

    利用高通量篩選技術可以快速鑒別先導化合物，但通過組合化學構建的化合物庫，首先是存在結構多樣性差的問題，這降低了化合物開發的成功率；其次是化合物的類藥性差，使大量的化合物在ADME篩選期間被淘汰，增加了實驗成本。過去的20年，雖然藥物發現階段的新技術層出不窮，但每年上市的新化合物實體卻沒有實質性增加。另外，目前所建立的高通量測定方法多數與所試驗的化合物結構類別有關，並不具有完全的通用性。

一、虛擬篩選方法

雖然已經開發出了許多體內和體外微量化、簡單化、自動化的實驗方法，在分析時間、勞動強度、處理化合物的數量方麵已經得到了很大的改善，但實驗方法仍然被認為是慢速的、花費大、且需要進行候選化合物的合成。虛擬篩選方法可以看作是一種替代方法，用於預測候選化合物的ADME特征。該方法具有高通量或超高通量。

（一）小腸吸收預測

口服吸收與藥物在胃腸道內容物中的溶解度、解離度以及跨過胃腸細胞膜的能力有關。因此化合物的理化性質是其小腸通透性的重要決定因素。提高藥物口服吸收的方法有：
1. 基於Lipinski的五規則(role of five)方法。在化合物結構中將N和O原子看作成氫鍵的受體，而將N—H、O—H基團看成是氫鍵的供體。通過軟件計算醇水分配係數ClgP。如果一個化合物滿足下列兩個以上條件：
    ●氫鍵供體數>5
    ●氫鍵受體數量>10
    ●ClgP>5
    ●MW>500Da
    則這個化合物將被給予開發警告標誌，未來的成藥性有疑問。本方法不適合存在主動轉運機製的口服藥物預測。
2.第二種方法也是利用Lipinski的五規則，但結合親脂性和分子大小信息，判定化合物口服吸收時的被動吸收情況。將化合物的內在親脂性(考慮到在生理pH下的解離度)ClgD與測定分子大小的參數計算分子折射率(calculated molecular refraction，CMR)進行繪圖。化合物被分成了4個象限，在第1和第3象限，化合物具有適當的親脂性，可以進行跨膜轉運；在第2象服，化合物的分子小、親水性強，可以通過細胞間隙吸收；而在第4象限的化合物因分子量大、親水性強，使化合物跨膜吸收困難。根據化合物所在的象限不同就可以對化合物的通透性作出預測。
3．采用分子極性表麵積(polar surface area，PSA)作為藥物吸收的預測方法。研究表明：PSA和分子量與通過Caco-2細胞獲得的表觀通透性指標具有相關性。

（二）血腦屏障(BBB)的通透能力預測

在新藥發現階段，對作用於中樞神經係統的藥物需要該藥物具有一定的BBB透過能力，而對於作用於外周的藥物，要求其透過BBB的能力越低越好，以減少藥物的中樞神經係統的不良反應。為此需要進行候選藥物透過BBB的能力預測。
Van de Waterbeemd給出了一種BBB通透性預測方法，MW<450 psa="">90Å被認為具有BBB透過能力。但該方法沒有考慮P-gp的影響。

（三）代謝穩定性的預測

要獲得最佳的生物利用度需要有適當的吸收和代謝穩定性。目前已知化合物的脂溶性、分子大小和形狀、存在的功能團和位置影響著藥物的體內穩定性。其原因可以歸結於化合物的結構能否進入P450的結合催化位點。有關這方麵的模型還處在發展初期。
據報道，目前虛擬篩選方法的預測能力在60％～90％之間，且使用的經驗模型與所采用的化合物訓練集有關。未來需要采用更多結構各異的化合物對模型進行驗證，還需要搞清楚體內ADME機製，建立機製模型進行預測。

二、體外方法

在過去的10多年裏，體外方法已經被廣泛用於通透性、生物利用度、代謝穩定性、藥物相互作用以及藥物理化參數的決定。體外方法的優點一是可以采用微量化、自動化等手段建立高通量或中等通量的模型；其次是可以使用來自人體的組織細胞成分進行研究，以消除人類和動物之間存在的種屬差異，提高藥物研發的成功率。但體外研究缺乏體內研究所存在的血流、生化因子以及多種轉運蛋白等影響因素，另外，化合物配製過程中使用的有機溶劑可能會掩蓋藥物在體內的溶解性能、影響藥物代謝酶的活性。

（一）小腸吸收的評價模型

藥物進入體內循環，需要在口服給藥後經過胃部的低pH環境，進入十二指腸和小腸，經過溶出釋放後在小腸上皮細胞吸收入血。小腸上皮細胞吸收的方式有4種：跨細胞攝取、細胞間透過、載體介導的攝取以及載體介導的流出。目前已經開發出了幾種體係來評價藥物的口服吸收。常見的有Caco-2細胞係、MDCK細胞係、PAMPA人工膜方法。其中PAMPA是基於被動擴散方式的吸收評價模型，屬於高通量研究方法，而Caco-2細胞係、MDCK細胞係屬於低通量方法。

（二）代謝穩定性研究

藥物進入體內後作為外來物將經曆由藥物代謝酶所致的生物轉化。雖然有時存在於小腸上皮細胞的P450同工酶，如CYP3A4，可以導致藥物首關效應，但肝是體內最大的代謝器官。肝中存在Ⅰ相代謝酶如P450酶、非P450酶如酯酶、黃素依賴單氧化酶、單胺氧化酶等；Ⅱ相代謝酶如葡萄糖醛酸轉移酶、磺基轉移酶等。上述酶中，P450酶又是體內主要的代謝酶。在P450的同工酶中，CYPlA2、CYP2A6、CYF2B1、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4是與藥物代謝有關的酶，其中CYP3A4又是P450酶中含量最大、代謝藥物比例最高的酶，可以占到代謝藥物總數量的50％。代謝穩定性是藥物的一個重要特性，代謝不穩定的藥物需要頻繁給藥才能保持藥物的治療濃度。
由於代謝方麵存在種屬差異，在藥物研發階段使用來自人體的組織、細胞獲得的結果與臨床結果更接近。在酶代謝穩定性研究中使用的體外係統主要為人類肝微粒體、肝細胞。目前已知肝微粒體含有的P450酶及其比例與肝組織中的比例接近，肝微粒體易於保存，可進行高通量的酶穩定性研究。肝細胞中含有完整酶係，不需要添加輔助因子，但肝細胞保存時間短、來源受限。

（三）理化參數的確定

在藥物發現階段，候選化合物的理化參數，如溶解度、解離常數、親脂性等影響著藥物的吸收、分布、代謝和排泄，因此有必要在藥物發現階段對這些理化參數進行確定。目前已經開發出高通量的理化參數確定方法。
1. 溶解度
經典的溶解度測定方法為搖瓶法，因測定時需要達到飽和狀態，因此試驗周期長(最長可達7天)，使用藥物量大，不適合高通量研究。人們後來開發了多種高通量測定溶解度的方法，在藥物發現階段常用的有比濁法和UV測定法，這兩種方法每天可以測定上百個化合物的溶解度。
2. 親脂性
親脂性表示化合物或其中部分基團對親脂性環境的親和能力。一般用化合物在兩相的分布行為表示，如正辛醇—水分配係數。親脂性可以用於預測藥物的通透性和代謝穩定性。一般地，化合物的親脂性越強(如lgD>5)，則該化合物的膜通透性越強，在體內越容易被肝藥酶代謝；而親水性的化合物(1gD<0)，則不容易透過細胞膜，在體內易於被腎排泄。一個合適的藥物，親脂性lgD在0～3之間，在體內表現出溶解性和親脂性的平衡。常用的測定方法有搖瓶法，其原理是將待測化合物溶解在緩衝液中並加入一種不相混溶的溶劑，達到平衡後分離兩相，測定水相的pH，以及化合物在水相和有機相的濃度。計 算出的脂溶性是在特定pH時部分解離狀態下的分配係數，用lgD表示。如果采用的是化合物不解離係統如中性係統，則計算的結果為lgP。脂溶性的高通量測定方法有HPLC方法，測定化合物在流動相和非極性固定相(如C。鍵合相)之間的分配係數來確定(用保留時間表示)；其他方法有96孔板結合紫外吸收測定的方法。
3. 解離度
化合物的解離度可以幫助了解在不同pH情況下化合物的解離程度，當pH＝pKa時，化合物一半處於解離狀態，一般處於中性狀態。胃腸道和生物內環境均處於不同的pH狀態，影響著藥物的解離狀態，從而對藥物的溶解度、親脂性產生影響，進一步影響到藥物的吸收及與蛋白結合。以往常規的測定pKa的方法是采用電位滴定法，該法通量較低、需要的樣品量大，一天僅可測定10個化合物，其他方法有毛細管電泳法，該法需要的樣品量很少，但通量也僅為每天10個化合物。高通量的方法主要為光譜梯度分析法(spectral gradient analysis，SGA)，可以使用96孔板，一天的通量可以達到240個化合物。
為了確定藥物之間存在的相互作用潛力，製藥界主要按照下述方法進行實驗。

（四）藥物相互作用研究

藥物因藥代動力學方麵所引起的相互作用而收回的例子已經有多個，而出現這種情況主要有兩種機製：酶抑製和酶誘導。
1. 代謝酶的確定
找出負責藥物體內代謝的關鍵酶，評價待測藥物與抑製劑或誘導劑之間的相互作用潛力。例如，如果一個藥物主要由CPY3A4代謝，則這個藥物可能與CYP3A4抑製劑如酮康唑、紅黴素、伊曲康唑或誘導劑如利福平、苯妥英之間產生藥物相互作用。在進行藥物相互作用潛力研究時，可以使用提取的肝微粒體、重組表達的肝微粒體、肝細胞。通過重組表達的肝微粒體可以進行藥物代謝酶的確定；肝微粒體和某一P450同工酶抑製劑合用也可以用於推測藥物代謝酶；人類肝細胞和抑製劑合用可以用於藥物代謝途徑的確定，因為肝細胞除Ⅰ相代謝酶外還包括Ⅱ相代謝酶。
2. 評價候選化合物對關鍵的藥物代謝酶的抑製潛力
如果一個化合物是藥物代謝酶的抑製劑，則可以與該酶的藥物底物產生藥物相互作用。研究時使用肝微粒體和特殊的底物就可以進行酶抑製潛力的研究，根據計算得到的IC50或Ki值，判斷藥物相互作用潛力。也可以使用重組表達的肝微粒體以及肝細胞進行研究。本項研究可以采用高通量的方式進行。
3. 誘導潛力
一個藥物如果可以誘導肝細胞過度表達某個代謝酶，則這個藥物可以與這個藥物代謝酶的底物產生藥物相互作用。本項研究隻能使用活的原代肝細胞才能進行，實驗需要持續2-4天，該種方法屬於低通量方法。另外一種方法是使用XPR-reporter細胞係進行研究，可以提高研究的通量。已知XPR是CYP3A4誘導劑的受體，藥物與XRP結合會導致相連的reporter基因活化，從而提示該藥物是CYP3A4的誘導劑。
另外，需要關注的是藥物轉運蛋白所引起的藥物相互作用；還應對抑製的機製進行分析，區分是否是競爭性酶抑製還是機製依賴性酶抑製。據報道，機製依賴性酶抑製引起的藥物相互作用的幾率更高。另外，Ⅱ相代謝酶的抑製作用也需要關注。

三、體內方法

在藥物發現階段，動物體內研究從給藥劑量、采血點、動物數量方麵與藥物開發階段的體內研究區別很大。這個階段，體內研究的目的主要是用於先導化合物的優化，結合體外研究結果對候選化合物的進一步研究提出建議。體內研究是一種低通量、耗時、所需樣品量大、不經濟的研究方法，但體內研究擁有體外研究所沒有的血流、各種因子等影響因素，是新藥研究中不可缺少的一項。在體內研究中，為提高通量一般采取兩種方法：提高分析速度和減少樣品數量。

（一）提高樣品分析速度

在體內研究中，有大量的樣品需要測定。提高測試速度是提高通量的最常用的方法。樣品分析一般為HPLC方法和LC-MS/MS方法。由於待分析的化合物結構各異，因此，所建方法需要一定的靈敏度和專屬性。HPLC因方法建立時間長、樣品處理步驟多，不能瞞足高通量測試要求。LC-MS/MS由於具有靈敏度高、專屬性好、樣品處理簡單(生物樣品進行蛋白沉澱即可)的特點在樣品分析中使用得越來越多。該法的缺點是基質效應的影響。另一個提高測試速度的方法是采用在線(on line)固相萃取(SPE)方法，自動進行樣品處理，該方法的缺點是方法建立仍然繁瑣、分析時間長。
還有一種提高通量的方法是進行濁度流動分析(turbulent flow)色譜，可以使用血清、尿樣品，不加處理直接進行分析。其他提高分析速度的方法如使用MUXTM係統的平行LC-MS/MS分析。一般可以使用4根色譜柱，每根色譜柱的流出物被依次引入到MS/MS的離子化室內。與使用1根色譜柱的LC-MS/MS相比，這種方法的分析速度可以提高近4倍。在色譜柱方麵，縮短分析時間可以采用細粒填料的短的色譜柱。使用這種色譜柱的液相色譜稱為陰分離液相色譜。如使用細粒短柱(2.1mm×20mm，3 μm或更細填料)、通用快速梯度(有機相在2分鍾內由5％到95％，流動性中含有0.035％～0.05％三氟乙酸或0.1％甲酸或10 mmol/L乙酸銨)、高流速(1-5 ml/min)等，這些操作可以使每個樣品分析時間僅為30s。

（二）減少樣品數量

在體內研究中，減少樣品的數量可以通過盒式給藥(cassette dosing)的方法，將幾種藥物合用，一次取樣就可以通過LC-MS/MS將幾個藥物的濃度同時測定出，該種方法的最大爭議是可能存在的藥物相互作用；另一種方法是將數個含有不同藥物的樣品混合後一同測定，也可以將給藥後不同時間點的血樣等量混合來粗略估計藥物在體內的AUC。
需要強調的是應建立與測定速度配套的數據處理係統。通過使用不同的軟件，使獲得的數據能夠生成易於被決策者辨認的報告。