hjc黄金城質粒構建服務

hjc黄金城生物分析部提供全麵符合FDA/OECD/CFDA GLP的生物分析服務，以支持小分子藥物、生物製劑、疫苗和PD生物標記物的篩選與開發，及其臨床前研究和臨床研究。

hjc黄金城分子生物學服務項目

質粒製備（準備）
亞克隆 
ORF克隆
基因突變
分子診斷

質粒構建服務流程

質粒構建過程

1、引物設計
2、目的片段選取：RNA提取、RNA反轉錄、PCR擴增、PCR產物純化
3、雙酶切
4、連接:1)雙酶切後，可將質粒酶切產物瓊脂糖電泳1-2ul;2)酶切產物液相純化；3)20ul連接體係
5、轉化
6、菌落PCR
7、測序：1)搖菌；2)送樣; 3)比對 ；
8、菌種保存：菌種比對成功，則可保存菌種備用。
9、質粒提取：菌種比對成功，凍存菌種後，菌液用於提取質粒。

一、基本原理
分、切、連、轉、篩

1、分：分離出要克隆的目的基因及載體。

2、切：用限製性內切酶切割目的基因和載體，使其產生便於連接的末端。
限製性內切酶：是一類能識別雙鏈DNA中特定堿基順序的核酸水解酶。
限製性核酸內切酶根據識別切割特性，催化條件及是否具有修飾酶活性分為三大類。
其中Ⅱ型酶能識別雙鏈DNA的特異順序，並在這個順序內切割，產生特異性DNA片段。時DNA重組技術中常用的酶。
Ⅰ型酶：具有修飾和切割功能，無固定切割位點
Ⅲ型酶與Ⅰ型類似，能識別特異位點，但切割位點在識別位點以外
Ⅱ型酶特點：
①識別順序一般為4－6個堿基對
②識別順序具有180度的旋轉對稱性，呈完全的回文結構
③Ⅱ型酶對雙鏈DNA兩條鏈同時切割，可產生兩種不同末端：平末端，粘末端
平末端：在識別順序的對稱軸上，對DNA同時切割形成平末端，如：SmaI  
5’－CCC GGG－3’                           5’－CCC           GGG－3’
3’－GGG CCC－5’                           3’－GGG           CCC－5’
5′突出粘末端：在識別序列的兩側末端切割DNA雙鏈，於對稱軸的5 ′末端切割產生5 ′端突出的粘性末端，如：Hind Ⅲ 
5’―AAGCTT―3’                          5’― A               5’－AGCTT―3’
3’―TTCGAA―5’                          3’― TTCGA－5’               A―5’
3′突出粘末端:與5′突出粘末端作用相反，產生3 ′端突出粘末端，如：PstI
5’―CTGCAG―3’                          5’―CTGCA－3’               G―3’
3’―GACGTC―5’                          3’―G               3’－ACGTC―5’
命名：酶來源的生物名稱縮寫
屬名-種名-株名-發現次序
根據其來源命名。如：EcoRI來源於大腸杆菌E.coli的RY13菌株,I指在該菌株中分離的第一個限製
酶活單位定義：在適當的條件下（T，pH，離子強度等）一小時內完全酶解1ug特定DNA底物所需要的限製性核酸內切酶的量，定義為1個活性單位。
目前常用的酶單位的定義是：37℃ ，1小時內50ul反應體係完全酶解1ugλ DNA所需的酶量。
在建立酶切體係時，酶的用量一般為1－5U/ugDNA。
   
3、連：將切割後的目的基因和載體用T4DNA連接酶連接。
①來源：T4DNA連接酶是T4噬菌體基因30編碼的產物。最早是從T4噬菌體感染的大腸杆菌中提取的。分子量為68KD，。
②最佳pH7.2-7.8，常用的反應液為pH7.6的Tris－Hcl
③需要ATP作為輔助因子並由ATP提供能量
④DTT等巰基化合物可促進連接酶的連接作用
⑤高濃度的鈉、鉀離子等抑製酶活性

4、轉：把連接好的重組載體轉化入感受態細胞的過程（細菌：E.coli，真菌：Yeast，昆蟲細胞或哺乳動物細胞）。
5、篩：在不同層次上、不同水平上進行篩選，鑒定所需的特異性重組子。使用各種方法，將帶有重組載體的宿主菌從培養基中篩選出來。例如：載體大小，酶切結果，篩選標記等。

二、操作步驟
①酶切產物回收
1. 將單一目的DNA條帶切下，放入幹淨的ep管中，稱取重量。
2. 向膠塊中加入3倍體積的溶膠液PN（如膠塊重量為100mg則加入300ul溶膠液PN），50℃水浴放置10min，間隔2min翻轉ep管數次，以確保膠塊充分溶解。
3. 膠塊完全溶解後，溶液降至室溫後將液體加入一個吸附柱（吸附柱放入收集管中），12000rpm離心30s，棄濾過液，將吸附柱重新放入收集管中。
4. 向吸附柱中加入700ul漂洗液PW，12000rpm離心30s，棄廢液，將吸附柱重新放入收集管中。
5. 向吸附柱中加入500ul漂洗液PW，12000rpm離心30s，棄廢液，將離心吸附柱放回收集管中，12000rpm離心2min。將吸附柱室溫放置5min徹底晾幹。
6. 將吸附柱放入一個幹淨的ep管中，向吸附膜中間位置懸空滴加30ul洗脫緩衝液EB，室溫放置2min，12000rpm離心1min。

②連接：連接體係一般為10-25ul，16℃連接過夜。

聯係我們

郵箱：marketing@yakkaa.com

電話：02158591500

以上是關於質粒構建服務,質粒構建公司,質粒構建步驟的內容，來源於hjc黄金城官網。

相關內容推薦