hjc黄金城藥效服務賦能First-in-Class泛素化抑製劑研發

2022-11-24

訪問量：

泛素-蛋白酶體係統（UPS）功能紊亂與多種疾病的發生具有密切關係，包括腫瘤、心血管疾病、神經退行性疾病等。因此，UPS已經成為相關疾病治療的熱門靶點之一。抑製泛素-蛋白酶體係統，調控相關底物蛋白的降解，實現疾病治療是重要的藥物開發策略，目前靶向泛素-蛋白酶體係統的小分子抑製劑研究主要有泛素活化酶E1抑製劑、泛素結合酶E2抑製劑、泛素連接酶E3抑製劑以及蛋白酶體抑製劑等。

TAK-243是一種首創的（First-in-Class）、高效的泛素活化酶E1 (UAE) 抑製劑。研究發現TAK-243具有顯著的抗腫瘤活性。其中，科研人員通過hjc黄金城使用HCC-70模型進行體內藥效實驗。結果發現腫瘤生長抑製率(TGI)達到91%。本篇文章結合文獻報道和hjc黄金城藥效部門的經驗，分享泛素化抑製劑研發的藥效研究案例，希望對關注泛素化研究和腫瘤藥效的各位科研工作者有所幫助。

泛素化

泛素分子在一係列特殊的酶作用下，將細胞內的蛋白質分解，從中選出靶蛋白分子，並對靶蛋白進行特異性修飾的過程。泛素化在蛋白質的定位、代謝、功能調節和降解中都起著十分重要的作用，也參與了細胞周期、細胞增殖、細胞凋亡、細胞分化、轉移、基因表達、轉錄調節、信號傳導、損傷修複、免疫炎症等眾多生命活動的調控。

泛素-蛋白酶體係統

泛素-蛋白酶體係統 (Ubiquitin-Proteasome System，UPS) 是細胞內負責蛋白質降解的多組分係統，介導真核生物80%以上的蛋白質降解，參與細胞的生長及分化、DNA複製與修複、細胞代謝、免疫反應等。泛素-蛋白酶體係統（ubiquitin-proteasome system，UPS）主要由泛素（ubiquitin，Ub）、泛素活化酶E1、泛素結合酶E2、泛素連接酶E3、去泛素化酶（deubiquitylating enzymes，DUBs）和26S蛋白酶體組成。

泛素-蛋白酶體係統（UPS).jpg

泛素-蛋白酶體係統（UPS)^[1]

泛素（ubiquitin，Ub）

泛素是一種廣泛分布在真核細胞中的高度保守的小分子蛋白。單個泛素分子由76個氨基酸殘基組成。主要功能是標記需要分解掉的靶蛋白，使其被26S蛋白酶體降解。泛素還可以標記跨膜蛋白，參與蛋白質的跨膜運輸。

泛素結構圖（來源：Wikipedia）.jpg

泛素結構圖（來源：Wikipedia）

泛素活化酶（E1）

泛素活化酶,也稱為E1酶，是泛素與底物蛋白結合所需要的第一個酶，在結構上含有位置固定的保守的半胱氨酸殘基，通過半胱氨酸殘基與泛素的C端形成高能硫酯鍵而激活泛素。對於調節泛素穩態和下遊泛素化依賴性細胞過程（包括通過泛素-蛋白酶體係統的蛋白水解和選擇性自噬）具有重要作用。

泛素結合酶（E2）

在泛素化過程中，泛素結合酶E2發揮非常重要的作用，是其中必不可少的中間環節。泛素結合酶E2是由許多蛋白質所組成的超家族，結構和功能方麵都存在多樣性。所有的泛素結合酶都含有一個保守結構域——UBC結構域。泛素結合酶 (E2) 將泛素從泛素活化酶 (E1) 轉運到泛素連接酶 (E3) 和底物中起關鍵作用。

泛素連接酶（E3）

泛素化級聯反應中的第三個酶，催化將結合在泛素結合酶上的泛素傳遞給目標蛋白質，泛素連接酶E3決定靶蛋白的特異性識別，在泛素化途徑中具有重要作用。泛素連接酶E3通過調控調節蛋白的泛素化過程參與細胞內的多種生理過程。所有的E3都具有連接靶蛋白和特定E2的能力。泛素連接酶E3結構域主要包括HECT結構域、RING結構域和U-box結構域。正是由於這些複雜多變的E3家族成員可以對不同底物進行特異性識別，泛素化途徑才呈現出蛋白降解的高度選擇性。

去泛素化酶（DUBs）

去泛素化酶家族負責通過水解泛素羧基末端的酯鍵、肽鍵或異肽鍵，將泛素分子特異性的從鏈接有泛素的蛋白質或者前體蛋白水解下來，起到去泛素化的作用，對蛋白降解進行反向調節，從而影響蛋白質的功能。

蛋白酶體（Proteasome）

26S蛋白酶體是降解泛素化底物的ATP依賴型蛋白水解複合體，由20S核心顆粒、19S調節顆粒和11S調節因子構成。26S蛋白酶體是泛素介導的蛋白質降解的中心蛋白酶。通過控製參與細胞凋亡、細胞周期和信號轉導的關鍵蛋白的降解，在細胞穩態中發揮重要作用。蛋白酶體具有多種功能，是藥物開發的重要靶標，特別是在腫瘤和神經退行性疾病中。在過去的二十年中已經鑒定了許多選擇性蛋白酶體抑製劑並批準用於臨床（如：Bortezomib，Carfilzomib等）。

26S蛋白酶體結構（來源：Wikipedia）.jpg

26S蛋白酶體結構（來源：Wikipedia）

泛素化過程

❖ 在ATP供給能量的情況下，泛素活化酶E1將泛素分子活化；形成E1-泛素的中間產物；

❖ 泛素活化酶E1將活化的泛素分子傳遞給泛素結合酶E2；形成一個E2-泛素的中間產物；

❖ 泛素連接酶E3先識別待降解的靶蛋白，再將結合E2的泛素連接到靶蛋白上，形成一個包含E2-泛素中間產物、E3 酶和靶蛋白的複合物；

❖ E2 酶和E3 酶，從上述的複合物中釋放，從而形成被泛素標記的靶蛋白；

❖ 重複上述過程，直到蛋白質上連接的多個泛素形成一條泛素鏈；

❖ 被泛素化的靶蛋白，被26S 蛋白酶體識別和降解。

泛素-蛋白酶體途徑.jpg

泛素-蛋白酶體途徑^[2]

泛素活化酶E1抑製劑

哺乳動物中的泛素偶聯由兩種關鍵酶啟動，即泛素活化酶UAE和UBA6，它們統稱為E1酶。UAE（由UBA1基因編碼）負責99%以上的細胞內蛋白泛素化，而UBA6負責<1%的泛素化。經典的E1酶均具有腺苷化結構域(AD)、催化半胱氨酸結構域(CCD)以及泛素折疊結構域(UFD)。首先，在ATP和Mg2+存在下，E1酶催化Ub與ATP形成Ub-AMP加合物並結合到E1酶的AD結構域，同時釋放是磷酸基團PPi，CCD結構域的半胱氨酸巰基親核進攻Ub-AMP鍵形成Ub-E1硫酯鍵並釋放AMP，另一個Ub非共價結合到AAD結構域，形成攜帶兩個Ub分子的E1酶。然後，攜帶兩分子Ub的E1酶結合E2酶，通過UFD將Ub轉移到E2酶上，形成Ub-E2複合物，接著參與下一個Ub的活化。因此，抑製E1酶活性能夠阻斷泛素分子的活化，抑製泛素化過程，是潛在的抗腫瘤靶點。

First-in-Class UBA1抑製劑TAK-243

TAK-243（MLN7243）是由Millennium研發的第一個進入臨床的UBA1抑製劑，從超過700個化合物中篩選發現的，能夠與Ub形成Ub-TAK-243加合物，進而結合到UBA1的ATP結合位點上，抑製UBA1活性。在多種癌細胞中能夠誘導泛素介導的p53、c-Jun、c-Myc、XIAP等蛋白積累並表現出明顯的抗腫瘤活性，目前處於治療晚期惡性實體瘤的一期臨床。

TAK-243是一種首創的泛素活化酶 (UAE) 抑製劑。通過形成TAK-243-泛素加合物有效抑製UAE。用TAK-243在體外處理細胞導致細胞泛素偶聯物丟失，導致泛素依賴性蛋白質轉換和信號傳導缺陷，細胞周期進程受損和DNA修複缺陷，蛋白毒性應激增加，最終導致癌細胞死亡。TAK-243在體內治療腫瘤細胞導致細胞多泛素化急劇減少，並在攜帶人異種移植腫瘤的小鼠中誘導顯著的抗腫瘤活性。

TAK-243具有高選擇性，抑製UAE, UBA6, NAE和SAE的IC50值分別為 1, 7，28，850 nM。TAK-243-泛素加合物一旦形成，就會與UAE緊密結合並阻斷UAE的催化活性。TAK-243抑製UAE將泛素分子轉移到E2酶。

A-TAK-243-的化學結構--B-TAK-243-泛素加合物的結構.jpg

A: TAK-243 的化學結構 B: TAK-243-泛素加合物的結構^[3]

TAK-243體內抗腫瘤活性研究

TAK-243的抗腫瘤活性分別通過使用PDX 和 CDX腫瘤模型進行研究驗證的。8至 12 周齡小鼠的側腹皮下接種腫瘤碎片或無血清培養基中的腫瘤細胞懸液。科研人員使用 CDX 模型在小鼠中建立了皮下腫瘤：WSU-DLCL2 (彌漫性大B細胞淋巴瘤)、HCT-116（結腸癌）、THP-1（急性髓性白血病）、CWR22（前列腺癌）、Calu-6 （非小細胞肺腺癌）、HCC-70（三陰性乳腺癌）和 MM1.S（多發性骨髓瘤），以及PDX 模型：PHTX-24c（結腸癌）、PHTX -132Lu（原發性NSCLC）、PHTX-55B（三陰性乳腺癌）、PHTX-235O（卵巢癌）和 HNM626（宮頸癌）。

在此項研究中，科研人員通過hjc黄金城使用HCC-70模型進行實驗。在每隻雌性裸鼠的腹部移植5.0×106 個HCC-70細胞形成HCC-70模型。當平均腫瘤體積達到約 200 mm3時，將動物隨機分組，每組 8隻動物。在隨後的21天時間內按每周兩次給藥TAK-243（12.5mg/kg) 和對照組 (20% HPβCD)。每周監測兩次腫瘤生長和動物體重。最後一次給藥後5天內計算TGI。

TAK-243對HCC-70的生長抑製曲線.jpg

TAK-243對HCC-70的生長抑製曲線^[3]

研究發現 TAK-243 在所有檢查的模型中都誘導了顯著的抗腫瘤活性反應。其中對CWR22、PHTX-235O、HCC-70和PHTX-55B的TGI達到90%以上。同時對動物體重幾乎沒有影響。

TAK-243體內抗不同腫瘤的活性.jpg

TAK-243體內抗不同腫瘤的活性^[3]

總結與展望

泛素在調節細胞蛋白質穩態和信號傳導中的不同作用突出了靶向 UPS 調節人類疾病的可能性。盡管有這種潛力，但在 UPS 中涉及的 500多種酶中，隻有一小部分是已進入臨床研究藥物可靶向的。蛋白酶體抑製劑Bortezomib的臨床成功引起了人們對 UPS 的其他成分進行研究的興趣和熱情。TAK-243是一種首創的、高效的UAE抑製劑，可完全抑製細胞泛素化，導致泛素依賴性蛋白水解受損、ER 應激以及細胞周期進程和 DNA 損傷修複受損。體內外數據表明 TAK-243 通過UAE抑製發揮其作用。TAK-243的發現為研究蛋白質泛素化提供了一個有價值的工具，並為研究蛋白質穩態和泛素信號傳導以用於腫瘤研究提供了新的機會。泛素-蛋白酶體係統是多種疾病特別是腫瘤的重要靶點，靶向該係統會獲得更高的選擇性。

參考文獻

[1] Marie W Wooten, et al. Signaling, polyubiquitination, trafficking, and inclusions: sequestosome 1/p62's role in neurodegenerative disease. J Biomed Biotechnol. 2006;2006(3):62079.doi: 10.1155/JBB/2006/62079.

[2]Ashok N Hegde, et al. The ubiquitin-proteasome pathway in health and disease of the nervous system. Trends Neurosci. 2007 Nov;30(11):587-95. doi: 10.1016/j.tins.2007.08.005. Epub 2007 Oct 24.

[3]Marc L Hyer, et al. A small-molecule inhibitor of the ubiquitin activating enzyme for cancer treatment. Nat Med. 2018 Feb;24(2):186-193. doi: 10.1038/nm.4474. Epub 2018 Jan 15.

[4] Isabella A Lambert-Smith, et al. The pivotal role of ubiquitin-activating enzyme E1 (UBA1) in neuronal health and neurodegeneration. Int J Biochem Cell Biol . 2020 Jun;123:105746. doi: 10.1016/j.biocel.2020.105746. Epub 2020 Apr 18.

[5] H. Yang, X. Chen, K. Li, et al. Repurposing old drugs as new inhibitors of the ubiquitin-proteasome pathway for cancer treatment. Seminars in Cancer Biology. 2021, 68:105-122.

[6] L. Cappadocia, C. D. Lima. Ubiquitin-like Protein Conjugation: Structures, Chemistry, and Mechanism. Chem Rev. 2018, 118(3): 889–918.

[7] J. A. Harrigan, X. Jacq, N. M. Martin, et al. Deubiquitylating enzymes and drug discovery: emerging opportunities. Nat Rev Drug Discov. 2018, 17(1): 57–78.

hjc黄金城藥理藥效服務

新藥研發的突破創新，離不開各種科技平台的強大支持。近年來，藥理藥效評價、動物模型和基因&細胞療法等技術不斷迭代更新，飛速發展，動物模型已在新藥研發進程中發揮著重要作用。不同疾病動物模型的建立為研究疾病發生與發展機製、篩選和評價抗疾病藥物提供了有力的工具。hjc黄金城擁有約30000平方米實驗室，通過AAALAC認證，加上充足的動物供應，可以執行小鼠、大鼠、兔、豬、狗、猴等動物的動物模型構建。

hjc黄金城藥理藥效部緊跟行業發展與市場需求，不斷完善創新，經過多年的經驗累積，多方驗證和長期實踐考驗，建立了完善的動物模型庫，可根據客戶的需求提供各種有效的動物模型，用來檢測藥物的有效性。實驗動物有非人靈長類動物、犬、大小鼠、兔、豚鼠、小型豬等種類。

❖ 已建立將近300種腫瘤評價模型，同時我們為創新療法賦能，全麵布局腫瘤免疫療法的評價和研究，已完成CAR-T，TCR-T, CAR-NK, 溶瘤病毒, 抗體（單抗，雙抗，多抗等），siRNA, AAV等免疫療法的模型建立及藥效評價。

❖ 根據客戶的需求提供各種有效的動物模型（腎衰模型、貧血動物模型、胃酸分泌動物模型、胃潰瘍模型等），用來檢測藥物的有效性。常規的消化係統疾病有：胃酸分泌、胃潰瘍、腎衰等，通過大鼠進行動物實驗。

❖ 在代謝性疾病領域具有數十個穩定有效的動物模型，尤其對於臨床缺乏有效藥物治療、且近期研發火熱的NAFLD疾病領域具有豐富的經驗和有效的動物模型。

❖ 為炎症免疫疾病藥物的藥效評價提供了多種針對不同靶點及通路，穩定可靠，擁有良好評價能力的動物藥效評價模型，為新藥的臨床轉化提供助力。

❖ 建立了涵蓋抗抑鬱藥、抗老年癡呆症藥、鎮靜催眠抗焦慮藥、鎮痛藥、抗驚厥藥、抗帕金森氏症藥以及抗精神分裂症藥等眾多疾病精神係統疾病模型評價技術，可以從分子水平、細胞水平、Ex-vivo、invivo等多層麵全麵評價一類創新藥物。

❖ 根據客戶的需求提供各種有效的動物模型，常規的動物模型有：全層皮膚創傷疾病動物模型、壓瘡潰瘍疾病動物模型、自發性高血壓大鼠疾病動物模型等，通過大小鼠、SHR大鼠等進行動物實驗。

PROTAC E3連接酶泛素化

【合作夥伴動態】安諦康生物榮獲“2022浙江最具投資價值創新企業”稱號返回展會預告| 初寒11月的行業會議有點“熱”