多克隆抗體製備流程

原理

抗體：介導體液免疫的重要效應分子，是B細胞接受抗原激活後增殖分化為漿細胞所合成分泌的一類能與相應抗原特異性結合的、具有免疫功能的球蛋白。
克隆(clone)： 是指無性繁殖細胞係，是由單一個祖先細胞分裂繁殖而形成的一簇細胞純係。在這個家族的所有成員中，如無突變發生，其基因是完全相同的。

多克隆抗體（polyclonal antibody, pAb）：用一種包含多種抗原決定簇的抗原免疫動物，可刺激機體多個B細胞克隆產生針對多種抗原表位的不同抗體。所獲得的免疫血清實際上是含有多種抗體的混合物，即多克隆抗體。

多克隆抗體製備的意義

免疫血清：將抗原注入機體所產生的抗體是針對多種抗原決定簇的混合抗體，含有這種特異性抗體的血清。
免疫血清作用：對傳染病的診斷、預防和治療有重要意義，而且對器官移植，腫瘤以及某些科研工作也有重要意義。

多克隆抗體優缺點

   優點 ：作用全麵，具有中和抗原，免疫調理，介導補體介導的細胞毒作用，ADCC等作用，來源廣泛，製備容易。
   缺點：特異性不高，易發生交叉反應，從而應用受限。

多克隆抗體製備流程

（一）免疫原的製備
（二）免疫動物
（三）免疫血清的收集
（四）免疫血清的鑒定
（五）免疫血清的保存

多克隆抗體操作步驟

一、免疫原的製備
免疫原（immunogen）指能刺激機體免疫係統產生特異性抗體或致敏淋巴細胞的抗原最重要的性質是免疫原性（immunogenicity）
免疫原—天然抗原、人工  合成抗原；蛋白質、多糖、脂類、核酸抗原；
（一）細胞性抗原製備：
   綿羊紅細胞（SRBC）- 溶血素；
   細菌- 抗菌抗體（動物免疫血清）
（二）可溶性抗原製備：指蛋白質、多糖和脂類等。
1）細胞的破碎（物理法、化學法）
2）提取與純化：

    ①超速離心分離—是一種根據分離物質的比重特點，通過差速或梯度密度離心，將分子大小不同的抗原顆粒分開的方法，隻適宜少數大分子物質的分離。
②選擇性沉澱—選擇某抗原理化特性，采用相應沉澱劑或溶液環境。
③超濾法—利用孔徑大小不同的特製薄膜對不同分子大小的抗原物質進行濾篩。
④層析法—凝膠過濾、離子交換、親和層析
⑤電泳——

3）鑒定：鑒定純化蛋白的含量、相對分子的質量、純度以及免疫學活性。
（三）半抗原性免疫原的製備

    1.載體選擇
常用載體：蛋白質、多肽聚合物、大分子聚合物。
（1）蛋白質類：常用的有人血清白蛋白、牛血清白蛋白、血蛋白等，其中以牛血清白蛋白最為常用。
（2）多肽類聚合物：是由人工合成的多肽聚合物，也是一類良好的載體，常用的有多聚賴氨酸。
（3）大分子聚合物：聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、羧甲基纖維素(CMC)等皆可與半抗原結合，加入福氏完全佐劑可誘導動物產生良好的抗體。
2.連接方法
         半抗原與載體的連接有物理法和化學法。
物理法   是用物理吸附法將載體與半抗原連接，其原理是通過電荷和微孔來吸半抗原，吸附載體主要有PVP和CMC等；
化學法   是利用某些功能基團把半抗原連接到白質類或多肽類聚合物載體上。不同的半抗原應選用不同的方法進行連接。

（四）免疫佐劑
某些物質與抗原一起或先於抗原注入機體，可增強機體對該抗原的特異性免疫應答或改變免疫應答類型，此類物質稱為免疫佐劑(immunoadjuvant)，簡稱佐劑。 

二、動物免疫
（一）免疫動物的選擇
選擇動物時應考慮以下因素：
（1）動物的選擇（選擇動物時應考慮以下因素）
①抗原來源與動物種屬的關係。抗原的來源與免疫動物種屬差異越遠，其免疫源性越強，免疫效果越好，而同種係或親緣關係越近，免疫效果越差。
②動物個體的選擇。適齡、健康、體重符合要求的正常動物（以雄性為佳）；抗體需要量少時，選用家兔、豚鼠和雞等小動物；抗體需要量大時，可選用綿羊、山羊、馬、驢等大動物。
③一般實驗室采用的抗體，多用兔子和羊；
（二）佐劑
概念：預先與抗原同時注入體內，可增強機體對該抗原的免疫應答或改變免疫應答類型的非特異性免疫增強性物質。
種類：佐劑一般包括以下幾類：
①無機佐劑：如氫氧化鋁、明釩等
②生物性佐劑：如結核分枝杆菌、卡介苗、小棒狀杆菌、百日咳杆菌、革蘭陰性杆菌內毒素、霍亂毒素的B亞單位、胞壁酰二肽和細胞因子等；
③人工合成佐劑：  如雙鏈多聚肌苷酸：胞苷酸（poly I：C）、雙鏈多聚腺苷酸：尿苷酸（poly A：U）；
④油劑：如弗氏完全佐劑、花生油乳劑等；
⑤納米佐劑 
佐劑主要作用機製：
①改變抗原物理性狀，延緩抗原的降解和排除，延長抗原在體內滯留的時間
②刺激單核-巨噬細胞係統，增強其對抗原的處理和提呈能力
③刺激淋巴細胞的增殖分化，從而增強和擴大免疫應答的能力.
（三）免疫乳劑的製備
（四）免疫動物

三、免疫血清的收集
采集免疫血清前，要預先測試抗體效價測定，若效價達到要求，應在末次免疫後一周及時采血，否則抗體效價會下降。
①頸動脈采血法
②心髒采血法
③靜脈采血法
 
四、免疫血清的鑒定 
1.效價的測定：顆粒性抗原可采用凝集試驗，可溶性抗原常用雙向免疫擴散試驗、ELISA等方法。
2.特異性的鑒定：抗體特異性鑒定常用雙向免疫擴散法、免疫電泳法
3.純度的鑒定：抗體純度的鑒定可采用SDS-聚丙酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）、雙向擴散試驗、免疫電泳等方法。IgG含有重鏈和輕鏈，純IgG的SDS-PAGE結果應有兩條蛋白電泳帶（分子量約53kD和22kD），若出現多條電泳帶則表明製備的抗體混有雜蛋白，需進一步純化。
4.親和力的鑒定：測定抗體親力的方法較多，如平衡透析法、ELISA或RIA競爭結合試驗等。

五、免疫血清的保存
取好血後，放入37℃，30min後，使血清充分析出（不能冰凍，否則產生溶血），經3000rpm/5min分離血清，剩餘放進-20℃冰箱保存。

以上是關於多克隆抗體製備的內容，來源於hjc黄金城官網。

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