肥胖和代謝綜合征人數在全世界範圍內迅速增長，並會導致高發病率和死亡率。醫療界一直在重點關注著肥胖及其並發症的發展預防和治療策略。在哺乳動物中，棕色脂肪組織（BAT）和白色脂肪組織（WAT）均可促進全身能量穩態，但是它們的解剖結構、形態和功能卻大不相同。
BAT的激活增加能量消耗，它的活性與身體質量指數和脂肪量成反比，這使得BAT有望成為一個抗肥胖治療劑。BAT由於其獨特的解偶聯蛋白1（UCP1）表達而產生熱量，該蛋白通過將質子動力與三磷酸腺苷的產生解偶聯來耗散能量。盡管UCP1的表達在基礎條件下僅限於BAT，但長時間的冷暴露或β3-腎上腺素刺激不僅可以增加BAT中UCP1介導的產熱能力，還可以激活WAT中褐色樣米色脂肪細胞的聚集。在成人中，WAT分布在全身並位於淺層脂肪墊上；但BAT存在於深層脂肪墊的較小區域，例如子宮頸、鎖骨上和椎旁區域。考慮到其豐富性和特殊位置，WAT更容易獲得和操縱。WAT誘導的褐變可能具有預防或治療肥胖症和與肥胖相關的代謝異常的巨大潛力。
在先前的研究中已經表明，小鼠UCP1的異位表達可以使骨骼肌和脂肪組織免受飲食誘導的肥胖，豬缺乏功能性的UCP1基因，而白色脂肪中UCP1的異位表達促進了脂解和耐寒性。這些研究清楚地證明了異位過表達的UCP1在動物中的抗肥胖作用。然而，尚不清楚通過激活內源性UCP1基因座位能否在人類中重現這些作用。
自體細胞療法是一種優選的治療幹預措施，其中將細胞取自個體並施用於同一個體以使免疫排斥最小。自體細胞療法一直是非常活躍的研究領域，如CRISPR。CRISPR-Cas9係統為哺乳動物細胞中的基因組編輯提供了強大的手段，並且已經在CRISPR-Cas9的基礎上開發了幾種新工具來實現基因表達的靶向抑製或激活。在CRISPR激活技術中，將核酸酶失活的Cas9與反式激活域融合，並由靶向特定啟動子的單向導RNA指導，該合成轉錄複合物可以激活內源基因的表達。CRISPR激活係統已被用於驅動各種小鼠和人類細胞類型的分化、轉分化和重編程。然而，尚未測試過CRISPR工程改造的細胞對全身代謝的影響及其對抗肥胖和與肥胖相關疾病的治療潛力。
CRISPR激活的高級版本之一是協同激活介體（SAM）係統，其中dCas9與融合蛋白結合，該融合蛋白由來自激活B細胞核因子κ輕鏈增強子（NF-κB）的兩個轉錄激活域組成和熱休克因子1（HSF1）協同促進轉錄。近日，研究人員在人類白色前脂肪細胞中使用了CRISPR-SAM係統來激活UCP1基因表達。除了表征這些CRISPR工程化的人類細胞外，還通過治療小鼠的肥胖症和代謝紊亂證明了這些細胞的治療潛力。該項研究成果發表在《Science Translational Medicine》上。
CRISPR-SAM對UCP1的內源性激活觸發了人類白色脂肪細胞中的褐色樣表型
研究人員采用了CRISPR-SAM係統來增加人類白色前脂肪細胞中內源性UCP1的表達，共設計了四種不同的指導RNA靶向人類UCP1上遊約50至150bp基因和穩定表達的編碼dCas9的載體與病毒蛋白轉錄激活子的四個串聯重複序列融合。將CRISPR-SAM係統與gRNA A到D的慢病毒轉導到源自兩個受試者的人類白色前脂肪細胞中。gRNA-A使UCP1 mRNA 增加約6000倍，使UCP1蛋白增加約20倍。這些發現表明，將靶向UCP1的 CRISPR-SAM和sgRNA結合使用，可以通過開啟內源性UCP1表達將人的白色前脂肪細胞改造成人的褐色樣細胞。
與缺少sgRNA的原始人類白色脂肪細胞相比，HUMBLE細胞在成脂分化後保持了較高的UCP1表達。然而，UCP1在HUMBLE細胞中的表達略低於同一個人的分化棕色脂肪細胞。與白色對照組脂肪細胞相比，HUMBLE細胞顯示出升高的GLUT1 mRNA。與棕色對照脂肪細胞相比，HUMBLE細胞導致線粒體活性和線粒體DNA含量增加。與白色對照脂肪細胞相比，HUMBLE細胞顯示出更細長且連接的線粒體網絡，類似於棕色對照脂肪細胞的線粒體形態。
除了具有棕色對照脂肪細胞的分子和結構特征外，HUMBLE細胞還獲得了棕色脂肪樣功能性表型。與白色對照組細胞相比，HUMBLE脂肪細胞使用葡萄糖作為底物時，其葡萄糖攝取量、基礎呼吸頻率、質子泄漏和福司可林（FSK）依賴性耗氧率（OCR）增加。與白色對照組細胞相比，它們還具有更高的脂肪酸依賴性OCR能力，而脂肪酸的攝取沒有改變。使用熱敏熒光染料，研究人員直接測量了培養細胞產生的熱量，發現與福司柯林相比，HUMBLE細胞比白色對照細胞產生更多的熱量。這些發現表明，HUMBLE細胞在使用葡萄糖或脂肪酸作為燃料來源方麵具有熱學能力。
HUMBLE細胞重構小鼠的功能性脂肪細胞
來源:Science Advances
基因工程或藥理誘導的米色/棕褐色細胞的移植可改善小鼠體內的代謝穩態。為了確定HUMBLE細胞在體內的代謝影響，將白色對照、HUMBLE和棕色對照前脂肪細胞與Matrigel混合，然後移植到免疫功能低下的裸鼠的胸骨區域。移植後2周，HUMBLE細胞在三種移植細胞係中顯示出最高的螢光素酶信號。到第4周在棕色對照細胞和HUMBLE細胞中都檢測到大量的UCP1表達，這表明棕色對照前脂肪細胞已分化為成熟的脂肪細胞，且UCP1表達上調。另外，分別通過小鼠CD31和酪氨酸羥化酶的陽性染色所示，移植的組織變得血管化和受神經支配。研究人員在小鼠血清中檢測到人脂聯素，這表明這些移植物具有可以作為內分泌組織分泌脂聯素或其他因子進入循環係統的功能。總之這些數據表明，移植的前脂肪細胞可以在體內重構脂肪組織，從而在體外概括這些細胞的表型。
HUMBLE細胞促進小鼠葡萄糖代謝和生熱
為了研究HUMBLE細胞是否能預防小鼠DIO代謝紊亂，研究人員監測了移植前2周接受45％高脂飲食（HFD）喂養的受體小鼠的代謝表型。接受HUMBLE和棕色對照脂肪細胞的小鼠比接受白色對照細胞的小鼠體重減輕。與接受白色對照細胞的小鼠相比，使用HUMBLE或棕色對照細胞移植的小鼠的葡萄糖耐量和胰島素敏感性也提高了約30％至35％。血清胰島素沒有統計學上的顯著變化。然而，與接受白色對照細胞的小鼠相比，在HUMBLE和棕色對照細胞組中循環甘油三酸酯的濃度降低了。與接受白色對照細胞移植的小鼠相比，棕色對照脂肪細胞移植使小鼠在冷暴露時能夠保持更高的核心體溫。
來源:Science Advances
為了進一步驗證HUMBLE細胞在體外和體內的代謝作用，研究人員使用從另一個個體和相同的CRISPR-SAM係統分離的白色前脂肪細胞生成了另外的HUMBLE細胞係。與上述對供體A41產生的細胞的保護作用一致，由供體A38產生的HUMBLE細胞在體外也顯示出很高的產熱潛力，並且當使用相同方案進行體內移植時，其糖耐量、胰島素敏感性和糖耐量均得到改善。這些結果表明基於CRISPR的HUMBLE細胞策略適用於不同的人類受試者。
巨大的細胞移植改善飲食誘發的肥胖小鼠的新陳代謝
來源:Science Advances
為了檢查使用HUMBLE細胞治療肥胖症的潛力，研究人員將細胞移植到DIO裸鼠中。移植了HUMBLE或棕色對照細胞的DIO小鼠的體重比移植了白色對照細胞的小鼠輕，這與葡萄糖耐量和胰島素敏感性的顯著提高以及移植後4周的循環胰島素濃度降低有關。與移植了白色對照細胞的小鼠相比，移植了HUMBLE或棕色對照細胞的小鼠的肝髒脂質含量降低了，內源性BAT和皮下WAT中的脂質滴大小相應降低了。總之，這些數據表明，HUMBLE細胞移植可能是潛在的抗肥胖治療策略。
HUMBLE細胞移植在體內激活內源性鼠BAT
來源:Science Advances
與具有白色對照細胞移植的小鼠相比，接受HUMBLE或棕色對照細胞的小鼠從循環中清除葡萄糖放射性示蹤劑的速度更快，這歸因於內源鼠BAT中葡萄糖的攝取增加，而不是移植細胞對葡萄糖的攝取增加。內源性scWAT或骨骼肌中的葡萄糖攝取或任何上述基因的表達沒有變化。從功能上講，與接受白色對照細胞的小鼠相比，接受HUMBLE或棕色對照細胞的小鼠的內源性BAT附近的表麵溫度更高，提示受體小鼠適應性生熱的激活。這些數據表明，HUMBLE和棕色對照細胞可以激活內源性BAT。
結果與討論
在本研究中，研究人員使用CRISPR-SAM係統工程改造了人類白色前脂肪細胞，以激活內源性UCP1基因並驅動類似棕色的表型。通過利用配對的人類白色和棕色前脂肪細胞係能夠將工程改造的HUMBLE細胞及其同基因的親本白色對照細胞與同一個體的真正的棕色對照細胞進行比較，從而提供準確的表型比較。研究數據證明了CRISPR工程化的HUMBLE細胞在預防和治療肥胖症方麵的臨床前治療潛力。HUMBLE細胞的移植可大大改善小鼠體內的葡萄糖穩態。
在研究中，移植的人類前脂肪細胞原位分化為脂肪細胞，更重要的是在肥胖的小鼠模型中，脂肪細胞功能所需的血管化和神經支配得以發展。此外，移植的細胞在體內存活了至少12周，因此這些細胞對小鼠體內葡萄糖穩態的有益作用得以持續。結果表明，基於HUMBLE細胞的療法可潛在地用於對抗高熱量飲食引起的代謝紊亂。
此項研究存在一定的局限性，研究人員使用免疫功能低下的裸鼠作為HUMBLE細胞移植的受體，以避免人類細胞移植的免疫排斥。但是，免疫受損的小鼠中特異性免疫細胞和細胞因子的缺乏可能會影響代謝評估的結果和解釋。CRISPR這一被稱為“魔剪”的基因編輯工具在基因工程應用方麵被寄予厚望，其憑借著成本低廉、操作方便以及效率高等優點已經成為了生物科研的得力助手，但不可否認的是CRISPR目前仍然麵臨著易脫靶等等的問題與挑戰，hjc黄金城作為新藥研發CRO也會繼續關注基因編輯技術的發展，期待CRISPR技術發展成熟的那一天，為人類健康貢獻力量。
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