雙分子熒光互補技術服務

一、技術簡介

BiFC是由Hu等在2002年最先報道的一種直觀、快速地判斷目標蛋白在活細胞中的定位和相互作用的新技術。

hjc黄金城建立和完善了PROTAC生物篩選與測試平台，hjc黄金城生物部具有成熟的PROTAC功能檢測及驗證技術，利用融合蛋白表達及雙熒光分子互補（BiFC)等技術，建立了高通量PROTAC 篩選平台，用以篩選靶向降解致病蛋白的PROTAC小分子。

有報道在GFP的兩個β片層之間的環結構（loop）上有許多特異位點可以插入外源蛋白而不影響GFP的熒光活性，BiFC技術正是利用該熒光蛋白家族的這一特性，將熒光蛋白分割成兩個不具有熒光活性的分子片段，再分別與目標蛋白連接。如果兩個目標蛋白因為有相互作用而接近，就使得熒光蛋白的兩個分子片段在空間上相互靠近，重新形成活性的熒光基因而發出熒光。在熒光顯微鏡下，就能直接觀察到兩目標蛋白是否具有相互作用，並且在最接近活細胞生理狀態的條件下觀察到其相互作用發生的時間、位置、強弱、所形成蛋白複合物的穩定性，以及細胞信號分子對其相互作用的影響等，這些信息對研究蛋白質相互作用有重要意義。

其後發展出的多色熒光互補技(multicolor BiFC)，不僅能同時檢測到多種蛋白質複合體的形成，還能夠對不同蛋白質間產生相互作用的強弱進行比較.這項技術不需要特殊的設備，相互作用的蛋白也不需要特別的理論配比。因此，BiFC技術已被國際上眾多實驗室采用，在活細胞內證明蛋白質的相互作用。本實驗室成功應用該技術研究轉錄因子c-Jun、ATF2和c-Fos在原代神經元中的競爭性相互作用。

BiFC技術以下幾個特點使其對於研究蛋白質相互作用具有獨特的優勢：

1、能在顯微鏡下直接觀察到蛋白相互作用而且不依賴於其它次級效應；2、該相互作用可以在活細胞中進行觀察，排除了由於細胞裂解或固定可能帶來的假陽性結果；3、蛋白質在近似生理條件的環境下表達，表達水平及特性如翻譯後修飾極大地接近於內源蛋白；4、不需要蛋白質有特別的理論配比，能檢測到不同亞群蛋白質間的相互作用；5、多色BiFC技術不僅能同時檢測到多種蛋白質複合體的形成，還能夠對不同蛋白質間產生相互作用的強弱進行比較；6、BiFC技術除了熒光倒置顯微鏡外，不要求特殊的設備。

實驗簡單、快捷、直觀，並適用於原核、真菌、植物、動物等多種組織、細胞. 該技術的完善與發展必然會為蛋白質組學、蛋白質相互作用連鎖圖的建立帶來福音. 但是，該技術與大多檢測蛋白質相互作用的技術一樣，也存在著假陰性和假陽性的問題，需要在實驗中仔細驗證。

二、實驗步驟

1. 將目的基因插入到含有N片段或C片段的載體中，構建成融合蛋白表達載體

2. 轉染細胞，熒光顯微鏡下觀察是否有相互作用。

三、應用實例

Fig1: Potassium deprivation increases BiFC signals formed by JunVN173 and ATF2VC155. CGNs were transfected with plasmids encoding JunVN173 (JunVN) and ATF2VC155 (ATF2VC) together with ECFP. JunΔL3VN were served as a control. After 16 hr, CGNs were switched to 25K, 5K media for 1h. Photos were taken on a fluorescence microscope at a magnification of 200×. The white arrows indicated the BiFC signals (Venus fluorescence). The transfected cells were lysed for Western blotting by anti-Flag and anti-ATF2 (20F1 CST). CFP were reprobed for normalizing the tranfection efficiency. The percentage of CFP-positive cells exhibiting Venus fluorescence was scored. Data were presented as means ± S.E., n=3, Student’s t test, p<0.05.