銀屑病藥效學模型及結果評價

銀屑病是以表皮角質形成細胞過度增殖和分化不全、真皮淺層微血管擴張並伴有炎症反應為病理特征的表皮角化性皮膚病，其發病機製迄今尚未完全清楚。綜合近年來的研究報道，關於銀屑病發病的新概念認為：銀屑病是多基因遺傳背景下T細胞失常的免疫性疾病，表皮過度增殖與分化異常和炎症等疾病現象涉及到細胞和分子水平的異常調控，後者是指在銀屑病中異常表達的免疫分子、細胞因子、炎症介質和調節分子。國外文獻報導ET-1(內皮素1)、sE-selectin（可溶性選擇素E）、sIL-2R（可溶性白介素2受體）、IL-6（白介素6）、IL-8（白介素8）、CD4+/CD8+等與銀屑病有關。

下麵簡要介紹一下幾種與銀屑病有關的體內外藥效學試驗模型及結果評價：

一、體內試驗

表皮細胞增殖過快和角化不全是銀屑病的基本病理特點，小鼠尾部鱗片的表皮缺乏顆粒層的形成，雌激素周期的小鼠陰道上皮細胞增殖活躍，上皮細胞轉換加快，均與人銀屑病表皮病理特征相似。藥物如能抑製小鼠陰道上皮有絲分裂和促進鼠尾顆粒層形成，就可能具有抗銀屑病作用。下麵兩種方法是被廣泛使用的較為經典的銀屑病藥效學模型：

1、對小鼠陰道上皮細胞有絲分裂的影響試驗

雌性小鼠預先注射雌激素（如乙烯雌酚）數日，使其處於雌激素生理周期。陰道給予藥物數日，末次給藥後腹腔注射秋水仙堿以終止細胞分裂。取小鼠陰道組織，固定，染色，觀察陰道上皮細胞的有絲分裂指數。常以甲氨蝶呤為陽性對照。
若試驗結果表明藥物有抑製陰道上皮細胞的有絲分裂的作用，則可提示對銀屑病的療效。

2、對小鼠尾鱗片表皮細胞生成的影響試驗

取小鼠，將試驗藥物直接在尾部外塗給藥一定時段(一般為2周)，取尾根部皮膚，固定，染色，測量鼠尾表皮厚度和顆粒形成情況。
 若試驗結果表明藥物有促進鼠尾顆粒層形成作用，則可提示對銀屑病的療效。
 

3、對鹽酸普奈洛爾所致豚鼠耳部皮膚銀屑樣皮損的影響

采用鹽酸普奈洛爾乳劑型搽劑（5％）連續塗抹豚鼠兩側耳廓皮膚，每日2次，連續2周後取少量豚鼠的兩側耳廓皮膚，固定，染色，光鏡觀察評價造模質量。於耳廓皮膚塗抹給藥，每日2次，連續2周。同法觀察耳部皮膚的角化層、顆粒層、棘細胞層、基底細胞層及固有層的變化情況，並測定表皮厚度。
若試驗結果表明藥物有對抗模型組所致的角化層角化不完全或過度、棘細胞層變厚、表皮厚度增加等狀況則可提示對銀屑病的療效。
該試驗也是一種考察銀屑病藥效作用的有效的動物模型。

4、對小鼠血清可溶性選擇素（sE-selectin）和血漿內皮素（ET-1）水平的影響。

小鼠連續給藥2周後，采用合適的方法測定血清可溶性選擇素（sE-selectin）和血漿內皮素（ET-1）的水平。
若試驗結果表明藥物具有降低血清可溶性選擇素（sE-selectin）和血漿內皮素（ET-1）的水平等作用則可提示對銀屑病的療效。
有文獻報道血清可溶性選擇素的水平與支氣管哮喘、過敏性紫癜、慢性乙肝等臨床症狀有一定的相關性，血漿內皮素水平也是多種病症的相關性指標，但二者與銀屑病的相關性尚不十分清楚。目前國內無這方麵的報道，國外對此種模型也尚處於初期研究階段。

二、體外試驗

1、對角質形成細胞增殖的影響（MTT法）

采用MTT法考察藥物對於各種角質形成細胞的生長的影響，采用的細胞有人永生化表皮細胞(HaCaT細胞)、角質形成細胞（Colo-16）等。 
角質形成細胞的過度增殖是銀屑病主要的發病因素之一，若試驗結果表明藥物具有抑製角質形成細胞增殖作用則可提示對銀屑病的療效。

2、對血管內皮細胞的增殖抑製作用（MTT法）

采用MTT法考察藥物對於血管內皮細胞的增殖的影響。
真皮淺層微血管擴張也是銀屑病的特征性病理變化之一, 有研究認為銀屑病血管變化先於表皮增生,而銀屑病血管生成增加的核心是血管內皮細胞的增生。
若試驗結果表明藥物具有抑製血管內皮細胞增殖作用則可提示對銀屑病的療效。

3、對角質形成細胞和血管內皮細胞周期的影響

采用流式細胞儀檢測方法對藥物處理過的角質形成細胞（如HaCaT細胞）和血管內皮細胞（如ECV304細胞）周期進行分析。對細胞增殖能力的有抑製作用藥物，其可能的用機製是阻止或延緩角質細胞從G1期到S期的過渡，或阻止於S期等抑製細胞周期的方式，導致細胞凋亡來發揮作用。

4、對角質形成細胞Cyclins/CDKs的影響

采用分子生物學的方法考察藥物對角質形成細胞（HaCaT細胞）CyclinE(細胞周期蛋白)、CDK2和CDK4等細胞周期調控因子表達影響。
正常細胞的增殖和分化依賴於細胞有序的周期活動。這一活動是由細胞周期依賴性蛋白（CDK）序慣性激活和失活所控製。CDK可被細胞周期蛋白（CyclinE、D）激活，又可被CDK抑製蛋白（CKI）所抑製。文獻報道，尋常型銀屑病患者皮損中細胞周期蛋白依賴性蛋白CDK4表達水平較正常人皮膚高。對角質形成細胞過渡增殖有抑製作用的藥物可能的作用機製是通過調節CDK4和CDK2的表達來影響細胞周期。

5、對角質形成細胞分化的影響 

采用分子生物學的方法考察藥物對角質形成細胞（HaCaT細胞）的轉穀胺酰胺酶1（transglutaminase1，TGase1）和角蛋白6（Keratin6，KRT6）表達的影響。
角質形成細胞異常分化是銀屑病主要臨床特征之一，TGase1和KRT6是表皮細胞分化的特異性標記蛋白。銀屑病皮損內可見TGase1表達減少，而KRT6表達增加的情況。對角質形成細胞異常分化有抑製作用的藥物可能作用的機製是通過對TGase1 mRNA表達和KRT6 mRNA表達的調節來實現的。

6、對角質形成細胞的維A酸受體RARs、RXRα及維A酸結合蛋白CRABPs表達的影響（針對維A酸類藥物）

采用分子生物學的方法考察藥物對角質形成細胞（HaCaT細胞）維A酸受體RARs、RXRα及維A酸結合蛋白CRABPs表達的影響。文獻報道認為,維A酸藥物的作用機製之一是通過與維A酸受體（RARs和RXRs）相結合而發揮活性，而細胞內維A酸結合蛋白CRABPⅡ被公認為維A酸唯一肯定的早期生物活性指標，CRABPⅡ通過直接轉運維A酸至其受體來調節維A酸活性，從而促進上皮再生，抑製炎症趨化，刺激KC分化。RARα、RARβ、RARγ、RXRα、CRABPⅠ和CRABPⅡ六個基因在HaCaT細胞中均有表達，RARγ表達最高，其次為RARα、RXRα，CRABPⅡ表達水平高於CRABPⅠ，RARβ僅微弱表達，但各基因之間的表達水平沒有差異。維A酸類藥物可能的作用機製是通過上述途徑發揮作用。

7、對角質形成細胞HaCaT細胞環氧合酶-2（COX-2）mRNA表達的影響

采用分子生物學的方法考察藥物對由LPS（脂多糖）誘導的角質形成細胞HaCaT細胞環氧合酶-2（COX-2mRNA高表達）趨勢的影響。在銀屑病患者外周血及皮損區可以檢測到多種與炎症相關的細胞因子的表達。前列腺素E2（PGE2）是參與炎症反應的重要介質，而環氧合酶是催化花生四烯酸轉化為前列腺素E2的關鍵酶，其誘導型同工酶COX-2是71kD的膜結合蛋白，被普遍認為與炎症反應相關。某些藥物可能通過抑製炎症反應介質PGE2的生成而抑製銀屑病的炎症反應症狀，其可能的作用機製是通過對誘導型同工酶COX-2的影響而發揮作用。

8、對銀屑病患者外周血淋巴細胞增殖的影響

有研究認為，銀屑病是一種以T淋巴細胞介導自身免疫性疾病。對T淋巴細胞增殖的影響試驗是較為常用的治療銀屑病藥物的試驗模型。
含藥物培養液孵育淋巴細胞2天，測定450nm波長、參比波長650nm下OD值以考察藥物對淋巴細胞增殖的影響。
若藥物表現出對淋巴細胞增殖的抑製作用，可提示其具有抑製銀屑病的免疫性的臨床症狀的作用。

9、對炎症因子及中性粒細胞趨化過程的影響

考察藥物對中性粒細胞趨化細胞因子IL-8（白介素8）和MCP-3（單核細胞趨化蛋白3）的趨化性影響。銀屑病皮損中有角質層下特征性的中性粒細胞聚集，是受化學趨化因子的吸引至此並被活化，活化的中性粒細胞又能影響表皮角質形成細胞的生長及分化，還能影響T細胞的活化狀態，而T細胞分泌的各種細胞因子如IL-1、6、8和IFN-γ等又可影響中性粒細胞在表皮的遷移,通過生成淋巴因子影響角質形成細胞產生促炎症介質。
若藥物可抑製IL-8 和MCP-3，則提示該藥物可影響中性粒細胞在表皮的遷移，從而影響角質形成細胞產生促炎症介質的過程而起到抑製炎症的作用。