原代細胞培養技術

一、分離階段注意事項

1、組織塊培養法
1）組織塊接種後的前3天，從組織塊向外遷徙的細胞數很少，組織塊的黏附不牢固，在觀察和移動的過程中，注意不要引起液體的振蕩。要避免經常翻動和振動，否則組織塊不易附著於瓶壁上或附著後也會脫落飄起。
2）加入的培養液不適合過多，避免浸泡的組織塊受輕微的波動而脫落下來。
3）用組織塊培養時，要及時觀察，當細胞向外遷徙出來後要注意記錄並去除漂浮的組織塊和殘留的細胞，因為已漂浮的組織塊和那些細胞碎片已經死亡，它們產生的有毒物質會影響原代細胞的生長，要及時清除。
4）為促進組織塊盡快粘貼在培養瓶皿上，可以在種植前先將膠原薄層塗在培養瓶底壁上。細胞培養過程中，膠原中的促細胞貼附因子先吸附於培養瓶底壁上，懸浮的圓形細胞再與已吸附有促貼物質的底壁附著。

2、貼壁型原代細胞
1)原代培養的分離細胞在初次接觸體外環境時，雖然被分散成單個細胞，但它們之間的互相影響還是存在的，而且這種影響對細胞能否存活是非常重要的。在這些細胞之間能產生一些促生長的活性物質，使細胞彼此互相促進存活和生長。如果接種的細胞密度過低，細胞之間的促生長作用很小，雖然營養物質很充足，也很難使細胞適應從體內的組織環境到被分散後進入獨立生存環境的變化過程。如果接種的細胞密度過大，會導致營養物質供應不足，代謝廢物積累較快需要經常換液和傳代。
2）原代培養時初始培養在組織分散和分離細胞時細胞可能會受到嚴重的損傷。適當增大原代培養接種的細胞密度，給培養的細胞提供更多的類似於在體內時細胞之間的相互作用，會極大提高原代培養的細胞在體外存活率。待細胞適應體外環境後進行傳代培養時再以較低的密度接種和培養。
3）由於細胞之間的相互的內在聯係被打破，分離細胞在體外培養時經曆的生存環境改變很大，在體外存活和生長的難度相應增加。對於貼壁依賴性細胞來說，盡快使接種的細胞貼壁，是決定培養能否成功的關鍵。可以在接種後先將培養瓶置培養箱內培養3h到5h，由於細胞懸液中帶有少量培養液，細胞即可以維持存活，又可以很快接觸到培養瓶底壁，是細胞迅速黏附於底物，待細胞貼壁後，再補足培養液繼續培養。

3、懸浮型原代細胞
1）進行懸浮細胞培養時必須保持細胞的懸浮狀態。可以通過增加培養液的黏度來幫助細胞呈懸浮狀態，如給培養液中加入低濃度的透明質酸複合物。在有攪拌裝置的培養器皿內加入培養液是，以5ml為最低限度，否則攪拌時會產生氣泡對細胞造成傷害。使用這種方式需注意勿使攪拌速度過快，否則即可使培養液溢出又容易造成汙染。如果培養液的量在5ml以下，可以采用旋轉瓶培養。給懸浮培養的細胞換液時要注意不要吸出細胞。
2）能夠進行懸浮培養的細胞，其生命力一般都比較旺盛，體外分裂增殖的速度較快，營養成分消耗大，換液時間隔一般較短。

二、分離後-傳代前注意事項

1、在原代培養的1天到2天內，要特別注意觀察是否有細菌、真菌的汙染，一旦發現，要及時清除，防止造成其它細胞的交叉感染；
2、在細胞培養的過程中，要注意培養液顏色的變化，並根據培養液的顏色來決定換液時間。正常情況下，培養液呈桃紅色；當培養液呈橙黃色時，細胞一般生長情況良好；呈淡黃色時，可能培養時間較長，營養不足，死亡細胞較多。所以，應在培養液略黃時吸出部分舊培養液，然後補加同等數量的新鮮培養液。換液過程中，不要吸出細胞，不要使培養液溢出培養瓶，避免各種微生物的汙染。換液時，應將培養液事先預溫至37℃。
一般培養一天，組織細胞即可在培養瓶皿底壁黏附並貼壁生長。2天到3天後，細胞恢複增殖活動。隨著培養時間的延長，細胞數量逐漸增多，消耗的營養物越來越多，需要換液的時間越來越短。

三、傳代注意事項

1、離體培養的細胞生命力比較脆弱，因此傳代時細胞沒有生長到培養瓶底壁麵積的80%以前，不要急於傳代。
2、首次傳代，由於原代培養中各種類型的細胞常混雜生長，傳代時不同細胞又不同的消化時間，因而要根據需要注意及時處理。
3、對貼壁細胞消化後的吹打過程要有序進行，吹打時動作不宜過猛，否則會直接損傷細胞並產生能傷害細胞的氣泡。
4、首次傳代時適當增大接種的細胞密度，使培養的細胞間盡快發生相互作用，有利於傳代細胞的存活。
5、傳代對細胞的影響或傷害程度僅次於將活細胞從生物體內取出並進行原代培養的程度。隻是因為傳代後的細胞生長並不像剛開始原代培養時那樣緩慢罷了。
6、盡可能減少傳代次數。每經過一次傳代，細胞的生長環境就相應發生一次較大變化。體外生長的細胞若處於動蕩的生活環境中，細胞的遺傳特性往往容易發生改變。經過多次傳代培養的細胞，往往容易轉化為惡性細胞