新方法直接測定藥物的靶點停留時間

藥物治療的前提是它們與細胞靶點的物理結合。這種結合的測定往往是在體外進行，無法充分模擬細胞內的複雜環境。Promega的科學家近日開發出一種新方法，可直接評估活細胞內靶點作用的動態過程。這項成果於近日發表在《Nature Communications》期刊上。

闡釋小分子調節劑如何與細胞內的靶點結合，對了解藥理機製十分關鍵。除了靶點作用（target engagement）的特異性和親和力，非平衡條件的結合動力學也決定了候選藥物的治療潛力。這些參數通常是通過生化方法來評估的，但無法充分模擬細胞內的複雜性。出於這個原因，製藥行業一直希望在完整細胞內評估靶點作用。

Promega的科學家利用NanoLuc技術開發出一種新方法，可測定活細胞中的靶點停留（target residence），作為靶點作用的重要方麵。這種技術利用生物發光共振能量轉移（BRET），允許實時測定活細胞內藥物與蛋白靶點的結合。

為了檢測藥物-靶點的相互作用，NanoBRET技術采用細胞通透性的熒光示蹤劑，旨在與NanoLuc標記的蛋白靶點相互作用。這種相互作用的結果是NanoLuc蛋白的能量轉移到示蹤劑上，產生一種可測量的信號。
如果小分子候選藥物與蛋白靶點相互作用，示蹤劑就需要和藥物競爭，這樣BRET信號減弱。藥物停留時間的測定依賴於化合物的預平衡、過量化合物的去除，以及示蹤劑的添加。實時信號監測顯示，緩慢解離的化合物阻礙示蹤劑的結合，使得BRET信號緩慢產生。

直接測定靶點作用

在藥物開發過程中，測定細胞中蛋白靶點與藥物的結合並將這種靶點作用與藥理作用相關聯是十分重要的。NanoBRET技術為直接評估靶點作用提供了一種簡單的方法。英國癌症研究中心曼徹斯特學院的Graeme Walker表示：“NanoBRET係統讓我能夠在活細胞中直接測定抑製劑的作用，我很期待將這種技術應用到其他靶點。”

測定靶點停留時間

NanoBRET技術一個更大的好處在於能夠測定靶點停留時間，這是藥物與蛋白相互作用的持續時間。這讓研究人員能夠優化藥物，以便增強作用。Walker補充說：“NanoBRET技術在保持細胞完整的同時，采用一種簡單的方法來測定化合物的停留時間。這種能力讓我們團隊能夠闡釋探針的新作用機製。”

NanoBRET技術是對BRET的大幅改良。它使用NanoLuc® 螢光素酶作為能量供體，而HaloTag® 蛋白標記的NanoBRET™ 618熒光基團作為能量受體，特別適合細胞水平蛋白相互作用的研究。