動脈粥樣硬化動物模型製作過程——hjc黄金城生物醫藥

 一、常用動脈粥樣硬化動物模型的比較
動脈粥樣硬化模型所用的動物有鼠、兔、豬、狗、猴，依上述理想動物模型的要求最常用的是兔、豬和鼠。各種動物誘導方法和形成特征的差異。

二、動脈粥樣硬化動物模型製作過程
主要介紹豬和兔兩種動物模型的製作過程。因其容易獲得、價格便宜、操作簡單，常為首選動物。

1、豬的動物模型

健康雄性中國小型豬，按統計學需要，自定數量。5～6月齡，稱其體重並記錄，隨機分為實驗組和對照組，每組數量相等，單籠飼養，對照組隻給基礎飼料，實驗組基礎飼料每隻動物按25g·kg-1/d分兩次給予，上午在少量基礎飼料中拌10%蛋黃粉和1.2%膽固醇，待吃完後再添足飼料。每月根據體重變化情況調整飼料量。兩組均自由攝水。為使動脈粥樣硬化模型更接近人的病變，可采用間接飼養法，於第17周停喂膽固醇和蛋黃粉4周，到第21周再恢複，並不再調整飼料量，直至第29周。

2．兔的動物模型

兔可選日本大白兔或新西蘭白兔（常用作內膜剝脫造型）。8周齡或成年兔，稱其體重記錄，隨機分組，單籠飼養。每日給膽固醇1.5g，上午以少量基礎飼料拌食，待吃完後，再添足基礎飼料（每日每隻120g），對照組則隻供基礎飼料，兩組均自由攝水，飼養10周。

以上均為高脂膳食法，此外還有一種較常見的造型法是剝脫內膜法，其操作是選用我國的大耳白兔，每天隻給0.5g膽固醇和大油1.5g，蛋黃5g，1周後經右股淺動脈，將3.5F球囊擴張導管插至腹主動脈20cm，球囊充液膨脹至2個大氣壓緩慢拉出，反複3次。

三、相關指標檢測

動脈粥樣硬化的模型檢測，大體包括病理形態學檢查，免疫組織化學檢查以及生化檢查三個方麵。

1．病理形態學觀察
為了對比，豬在14～29周，兔在5～10周，處死兩組動物（每周各一隻），作飼養過程的經過觀察。
（1）肉眼觀察主動脈沿縱軸剪開，蘇丹Ⅲ、Ⅳ混合染色，投影格子計數法分別計算每條主動脈內膜總麵積，胸、腹主動脈內膜麵積以及蘇丹Ⅲ、Ⅳ染色陽性的脂質條紋及隆起的纖維斑麵積，求出各類病變麵積百分比。冠狀動脈自心髒剝下，沿縱軸切開，蘇丹Ⅲ、Ⅳ混合液染色，按上述方法計算每條冠狀動脈內膜及其病變麵積，求出病變麵積百分比。在實驗組（豬）14周時脂質條紋麵積和纖維斑麵積的百分比分別是9.64%和1.56%左右。冠狀動脈在主支近端1/3處可見纖維斑。

（2）光鏡觀察從胸主動脈和冠狀動脈典型病變處分別取材，常規石蠟切片，厚4μm，HE染色。用目鏡測微尺於200倍鏡下測量動脈纖維斑或脂質條紋的最大厚度及中膜厚度，求其厚度比值，兩組的值應有顯著的差異。Masson染色片，光鏡下400倍計數三個視野的腹主動脈和冠狀動脈左前降支纖維斑內胞漿紅染的梭形細胞（視為平滑肌細胞）數。其值在兩組間亦應有顯著的差異。此外，尚可在實驗組見到內膜缺損或裂隙。

（3）電鏡觀察動脈處死後迅速取材（部位同光鏡），2.5g戊二醛及1%鋨酸雙重固定，常規製備樣品，以超薄切片機切片，乙酸鈉，檸檬酸鋁染色，透射電鏡觀察。掃描電鏡樣品經逐級酒精脫水，臨界點幹燥，鍍膜後觀察。在動物模型組應見到內皮細胞變性壞死脫落，見到髓磷脂小體，細胞間連接變直變寬，內皮下間隙擴大，有較多的平滑肌細胞（SMC）和泡沫細胞。泡沫細胞胞質內密集成群分布的大脂滴和膽固醇結晶，結晶使細胞核移位，胞體腫大，部分泡沫細胞崩解，如圖1所示。線粒體腫脹變性，多數SMC胞漿內充滿大量細胞器（粗麵內質網，高爾基體等）。但肌絲成分較少，間質可見彈力纖維增生，細胞外脂質沉積。

喂飼一年形成的高膽固醇血症猴的大動脈呈高度動脈粥樣硬化斑塊（fatty streak）表麵，內皮細胞呈複雜的凸凹不平。一部分細胞接合分離、巨噬細胞祼落、血小板粘著凝集。

2．免疫組化定性定位觀察
目前市場上有多種免疫組化所需的抗原抗體提供，針對LDL的動脈粥樣硬化斑可采用組化分析，用相應的LDL抗體為第一抗體的PAP法觀察LDL在動脈粥樣硬化病灶內的分布。LDL免疫活性陽性的顆粒主要分布在泡沫細胞周邊，在纖維斑塊內，LDL顆粒呈彌漫性分布，在病灶深部內彈力板附近，有大量LDL顆粒聚集成帶狀。

3．生化指標檢測
在動物飼養全過程中，每周應進行一次血脂測定。可在耳垂靜脈取血或心髒直接抽血。常測指標有血清總膽固醇（TC），某油三酯（TG），低密度脂蛋白（LDL），高密度脂蛋白（HDL），載脂蛋白AⅠ（ApoAⅠ），載脂蛋白B（ApoB）等，其動物模型，除ApoAⅠ和HDL外，其他各項指標與對照組比較出現不同程度的升高，尤其以TC、LDL、ApoB最為顯著。此外，血小板膜流動性（PMF）及丙二醛（MDA）也可用作參考指標。